二機能性タンパク質のダイナミックな構造と機能制御

• Project/Area Number: 23K23852
• Project/Area Number (Other): 22H02588 (2022-2023)
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund (2024); Single-year Grants (2022-2023)
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 43040:Biophysics-related
• Research Institution: University of Hyogo
• Principal Investigator: 久保 稔 兵庫県立大学, 理学研究科, 教授 (90392878)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥17,550,000 (Direct Cost: ¥13,500,000、Indirect Cost: ¥4,050,000); Fiscal Year 2024: ¥5,330,000 (Direct Cost: ¥4,100,000、Indirect Cost: ¥1,230,000); Fiscal Year 2023: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2022: ¥7,540,000 (Direct Cost: ¥5,800,000、Indirect Cost: ¥1,740,000)
• Keywords: 天然変性タンパク質 / クリプトクロム / 体内時計 / DNA光修復 / 動的構造解析

Outline of Research at the Start

近年、緑藻クラミドモナスにおいて、二つの機能をもち、それらを使い分ける奇妙な分子（タンパク質）が発見された。CraCRYと名付けられたその分子の二つの機能とは、 (1)体内時計の調節と(2)壊れたDNAの修復である。本研究では、X線、紫外光、可視光、赤外光、マイクロ波などさまざまな光を道具に用いて、二機能を制御するこの分子の巧みな設計原理を明らかにする。

Outline of Annual Research Achievements

クラミドモナスの動物型クリプトクロム（CraCRY）は、(1)光による体内時計の遺伝子調節（クリプトクロム機能）に加えて、(2)光を用いたDNAの修復（光回復酵素機能）も行えるbi-functionalタンパク質である。CraCRYは、光受容補因子FADを保持した光回復酵素様のドメイン（PHR）の末端に、天然変性領域（CTE）が付け足された構造をもつ。本研究では“FADの化学状態とCTEのダイナミクスの連関”に焦点を当て、CraCRYの二機能性制御の仕組みを明らかにする。
CraCRYのFADは環境に応じて、①酸化型（in vitroで安定な暗状態）、②セミキノン型（in vivoでの暗状態）、③還元型（in vivoでの明状態かつ光回復酵素機能の休止状態）の3つの化学状態をとる。R4年度は酸化型と還元型の試料調製法を確立し、X線小角散乱によりCTEの構造変化を明らかにした。R5年度はさらにNMRを用いて、酸化型と還元型の間のCTEの構造変化を解析し、一部帰属可能なシグナルに基いてCTE-PHR間の相互作用変化を明らかにした。また、セミキノン型の試料調製法を検討し、セミキノン型が主成分（約90%）となる試料調整法を見出した。一方、CraCRYの光回復酵素機能に関しては、時間分解紫外分光を用いて、R4年度中にDNA光修復ダイナミクスを捉えることにすでに成功している。R5年度はCraCRYと近縁の光回復酵素のDNA光修復ダイナミクスを観測した。現在それらを比較しながら、CraCRYのDNA光修復機構の特徴を抽出している所である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

セミキノン型単分散試料の調整方法がまだ確立していないため。

Strategy for Future Research Activity

セミキノン型CraCRYの調製方法について引き続き検討を続けると共に、セミキノン型CraCRYと酸化型CraCRYの二成分系に対するX線小角散乱解析を検討する。

Research Products

• [Presentation] 分光学から観たDNA光修復のメカニズム (2023)
  • Author(s): 久保稔
  • Organizer: 第35回高速分子動画オンラインセミナー
  • Invited
• [Presentation] 光によるDNA修復のメカニズムと分子進化 (2023)
  • Author(s): 久保稔
  • Organizer: 第1回ATIコンファレンス バイオ単分子研究会
  • Invited
• [Presentation] 時間分解振動分光による 酵素中間体の化学構造解析 (2023)
  • Author(s): 久保稔
  • Organizer: 蛋白研セミナー“タンパク質のダイナミクスと機能”
  • Invited
• [Presentation] 損傷DNAの光修復に関する分光学的研究 (2023)
  • Author(s): 山田大智、楞野亜衣、前野達海、重田育照、山元淳平、〇久保稔
  • Organizer: 第49回生体分子科学討論会
• [Presentation] X線小角散乱を用いた明状態二機能性クリプトクロムの溶液構造解析 (2023)
  • Author(s): 乾翔太、松田颯真、長尾聡、柳澤幸子、久保稔
  • Organizer: 第49回生体分子科学討論会
• [Presentation] NMR analysis of dynamics of the C-terminal extension in bi-functional cryptochrome (2023)
  • Author(s): Yuki Kaide, Satoshi Nagao, Wataru Sato, Minoru Kubo
  • Organizer: 第61回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Time-resolved spectroscopic analysis of DNA photorepair reaction catalyzed by cryptochrome (2022)
  • Author(s): 前野達海、山田大智、楞野亜衣、山元淳平、久保稔
  • Organizer: 第60回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Structural analyses of the animal-like cryptochrome from Chlamydomonas reinhardtii by small angle X-ray scattering (2022)
  • Author(s): 松田颯真、長尾聡、山田大智、久保稔
  • Organizer: 第60回日本生物物理学会年会
• [Book] タンパク質の構造解析手法とIn silicoスクリーニングの応用事例（第1章 第6節「ラマン分光法の構造生物学的利用」分担執筆） (2023)
  • Author(s): 久保稔, 山田大智
  • Total Pages: 530
  • Publisher: 技術情報協会
  • ISBN: 9784860435370