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受容体分子の時空間ダイナミクスの統合的理解による新規薬剤スクリーニングの基盤構築

Research Project

Project/Area Number 23K23856
Project/Area Number (Other) 22H02593 (2022-2023)
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

Allocation TypeMulti-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023)
Section一般
Review Section Basic Section 43040:Biophysics-related
Research InstitutionOsaka University (2023-2024)
Institute of Physical and Chemical Research (2022)

Principal Investigator

廣島 通夫  大阪大学, 大学院生命機能研究科, 特任准教授(常勤) (20392087)

Project Period (FY) 2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2024)
Budget Amount *help
¥17,290,000 (Direct Cost: ¥13,300,000、Indirect Cost: ¥3,990,000)
Fiscal Year 2024: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
Fiscal Year 2023: ¥6,890,000 (Direct Cost: ¥5,300,000、Indirect Cost: ¥1,590,000)
Fiscal Year 2022: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
Keywords1分子薬剤スクリーニング / 大規模1分子計測 / 1分子生体情報学
Outline of Research at the Start

細胞の外部からのシグナルは細胞膜上の受容体を通じて細胞内に伝達される。上皮成長因子受容体(EGFR)はその異常が多くの疾患と関与するため、創薬の標的分子である。細胞内の分子個々の動きを可視化する手法(1分子イメージング)により、EGFRの活性化が動きに顕著な変化を及ぼすことが見出されている。これは新しい活性化検出法であるため、開発中の全自動1分子解析システムと組み合わせれば、革新的な薬剤スクリーニングが実現する。しかし、活性化が分子動態を変化させるメカニズムは分かっていない。本研究では、分子構造や細胞膜環境と関連付けてメカニズムを解明し、細胞内1分子スクリーニングの基盤手法の実効性を裏付ける。

Outline of Annual Research Achievements

細胞応答に関与する細胞膜受容体において、分子の構造/動態/活性化が密接に関わりながら変化し下流シグナル経路を活性化する過程を、蛍光1分子イメージングによる大規模計測から分子状態を解析する手法を用いて感度良く捉え、一連の分子現象の時空間ダイナミクスを網羅した描像を提示する。分子レベルでのシグナル伝達のプロセスを、今までの知見のミッシングリンクを埋めて明らかにする。さらに得られた情報を基に1分子動態を指標とした新規の薬剤スクリーニングが可能となることから、実際に応用してその有用性を実証する。本研究では重大な疾病にも関わる上皮成長因子受容体(EGFR)を取り上げ、シグナル伝達時の分子状態(動態と多量体形成)について、野生型と構造変異体それぞれの1分子軌跡・輝点強度データを隠れマルコフモデルに基づく機械学習手法により解析している。計測は22-23年度に作成した4種類の構造変異体の細胞株に対して、数段階設定したリガンド濃度下で添加後の経時変化を追跡する。これらの試料や条件の組み合わせについて十分なデータ数を得るためには膨大な計測が必要であることから、我々が開発した全自動化細胞内1分子イメージングシステムを用いて大規模計測を行っている。また、この新しい大規模計測から得られた知見を基に、この手法がどのように薬剤スクリーニングに応用できるかについても検証する。さらに、非小細胞肺癌で多く見られるEGFRの癌変異体L858Rや、抗癌剤gefitinibによる治療で生じる薬剤耐性二重変異体 L858R/T790M、そしてこの変異に効くosimertinibに対しても耐性を獲得した三重変異体 L858R/T790M/C797Sについて、構造変異体と同様の計測を行ない、野生型や構造変異体との差異を定量的に評価し、薬剤の効果を効果的に検出可能な指標を探索する。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

構造変異体の計測では、当初予定していた細胞内領域、二量体化アーム、細胞外領域それぞれを欠損させたEGFR(ΔICD, ΔArm, ΔECD)のうち、ΔICDとΔArmについては順調に計測が進んでおり、新しい知見も得られてきた。また、分子構造に起因する動態がシグナル伝達にどう影響しているか、より詳細に探るため、当初の計画を越えてさらに1) C末端リン酸化領域、2) C末からキナーゼ領域まで、3) 細胞内領域全て、4) 二量体化アーム、5) 二量体アームと細胞内領域の両方、をそれぞれ欠損させた分子や、膜貫通ドメインの二量体間相互作用部位に変異を導入した分子(TM646, TM647)についても細胞株を既に作成し計測を進めている。その結果、EGFR各ドメインが動態や多量体形成に与える影響とシグナル伝達における役割に関して、想定していた以上のデータが得られている。なおC末端リン酸化領域を削った変異体の結果から、本研究で用いているCHO-K1細胞の内在性ErbB2とトランスフェクションしたEGFRとで形成するヘテロダイマーの影響が無視できない場合があったことから、内在性ErbB2をノックアウトした細胞株を構築した。今後、野生型EGFRをはじめ各種変異体について安定発現株の取得を進める。
また、スクリーニングへの応用を見据えた癌変異体の計測では、当初予定していたL858Rや薬剤耐性の二重変異体 L858R/D761YやL858R/T790Mに加え、二重変異株に効果のある薬剤に対して耐性を持つ三重変異株L858R/T790M/C797Sも細胞株を作成して計測を行っており、期待された効果が見られているとともに、耐性のメカニズムとの関連が示唆される結果も得られつつある。

Strategy for Future Research Activity

2023年度に引き続き、EGFRの構造変異体の1分子イメージングによる計測・解析を進め、シグナル伝達の調節機構における分子構造と動態の寄与を探る。変異体の種類は当初計画より増え7種類となり、それぞれリガンドと阻害剤濃度は3段階以上、時間は10秒枚の6段階となる。これらを組み合わせた条件下において、観測する細胞数はEGF刺激前後で >100細胞程度必要となる。従って計測では相当な量のデータ取得が必要となるが、我々の全自動1分子イメージングシステムを使用することで2024年度での完了を目指す。得られたデータから分子状態の解析を行い、EGFRの構造や局在、会合体サイズ、また細胞環境を統合的に記述し、また経時変化を追うことで、リガンド結合やリン酸化に伴う変化が、いつ、どこで、どのように生じるか、定量的指標と共に明らかにする。並行して、内在性ErbB2をノックアウトした細胞に変異体をトランスフェクションした細胞株の取得を進め、ErbB2の影響を受けないEGFR動態評価のプラットフォームを確立する。
さらに薬剤スクリーニングへの応用を念頭に、癌変異体を用いた計測も2023年度同様に進める。多量体サイズの定量も可能となった改良版の解析プログラムを用いて分子状態の平均マップを作成し、構造や環境を感度良く反映する有効なスクリーニング指標を見出す。またここで得られた知見を前項のEGFRによるシグナル伝達調節の統合的理解にも役立てる。加えて、癌変異体を標的分子として1万種程度の化合物ライブラリに対して薬剤スクリーニングの実証実験を行い、手法の有効性を評価する。

Report

(2 results)
  • 2023 Annual Research Report
  • 2022 Annual Research Report
  • Research Products

    (10 results)

All 2024 2023 2022

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 1 results,  Open Access: 2 results) Presentation (5 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Invited: 1 results) Patent(Industrial Property Rights) (2 results) (of which Overseas: 1 results)

  • [Journal Article] Automated single-molecule imaging for drug discovery2024

    • Author(s)
      Hiroshima M., Ueda M
    • Journal Title

      Proc. of SPIE.

      Volume: 12853 Pages: 1285308-1285308

    • DOI

      10.1117/12.3009718

    • Related Report
      2023 Annual Research Report
  • [Journal Article] 1分子イメージングの全自動化と大規模解析への応用2023

    • Author(s)
      廣島通夫、上田昌宏
    • Journal Title

      生産と技術

      Volume: 75 Pages: 77-81

    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Open Access
  • [Journal Article] Origin of diverse phosphorylation patterns in the ERBB system2022

    • Author(s)
      Okada Takashi、Miyagi Hiraku、Sako Yasushi、Hiroshima Michio、Mochizuki Atsushi
    • Journal Title

      Biophysical Journal

      Volume: 121 Issue: 3 Pages: 470-480

    • DOI

      10.1016/j.bpj.2021.12.031

    • NAID

      120007187502

    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] Automated single-molecule imaging for drug discovery2024

    • Author(s)
      Hiroshima M., Ueda M.
    • Organizer
      SPIE. Photonics West
    • Related Report
      2023 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Mechanism of mutation induced changes in single-molecule behavior of EGF receptor2023

    • Author(s)
      Hiroshima M.
    • Organizer
      Single Molecule Biophysics Conference SMB2023
    • Related Report
      2023 Annual Research Report
  • [Presentation] シグナル伝達を惹起する細胞膜上EGFR動態の1分子解析2023

    • Author(s)
      廣島通夫、上田昌宏
    • Organizer
      第61回日本生物物理学会年会
    • Related Report
      2023 Annual Research Report
  • [Presentation] 遺伝子変異が引き起こすEGFR動態変化の1分子解析2022

    • Author(s)
      廣島通夫、上田昌宏
    • Organizer
      第60回日本生物物理学会年会
    • Related Report
      2022 Annual Research Report
  • [Presentation] 1分子イメージングを用いた薬剤スクリーニング2022

    • Author(s)
      渡邉大介、廣島通夫、上田昌宏
    • Organizer
      第60回日本生物物理学会年会
    • Related Report
      2022 Annual Research Report
  • [Patent(Industrial Property Rights)] 受容体型チロシンキナーゼの活性評価方法2024

    • Inventor(s)
      渡邉大介、廣島通夫、上田昌宏
    • Industrial Property Rights Holder
      渡邉大介、廣島通夫、上田昌宏
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Filing Date
      2024
    • Related Report
      2023 Annual Research Report
    • Overseas
  • [Patent(Industrial Property Rights)] 1分子イメージングを用いた上皮成長因子受容体EGFRの活性評価に基づく薬剤スクリーニング法2023

    • Inventor(s)
      上田昌宏、廣島通夫、渡邉 大介
    • Industrial Property Rights Holder
      上田昌宏、廣島通夫、渡邉 大介
    • Industrial Property Rights Type
      特許
    • Industrial Property Number
      2023-031358
    • Filing Date
      2023
    • Related Report
      2022 Annual Research Report

URL: 

Published: 2022-04-19   Modified: 2024-12-25  

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