| Project/Area Number |
23K23859
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| Project/Area Number (Other) |
22H02596 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43050:Genome biology-related
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
岡部 篤史 千葉大学, 健康疾患オミクスセンター, 特任准教授 (80778118)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川島 祐介 公益財団法人かずさDNA研究所, ゲノム事業推進部, ユニット長 (30588124)
神田 輝 東北医科薬科大学, 医学部, 教授 (50333472)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000)
Fiscal Year 2024: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2023: ¥5,720,000 (Direct Cost: ¥4,400,000、Indirect Cost: ¥1,320,000)
Fiscal Year 2022: ¥7,150,000 (Direct Cost: ¥5,500,000、Indirect Cost: ¥1,650,000)
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| Keywords | クロマチン構造 / 胃癌 / Epstein-Barrウイルス / Epstein-Barr vius / Heterochromatin / Epigenetics / Chromatin structure / Epstein-Barr Virus |
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| Outline of Research at the Start |
申請者らは胃癌の網羅的クロマチン構造解析から、Epstein-Barrウイルス(EBV)陽性胃癌においてEBV-ホストゲノム相互作用が引き起こす、新規エピゲノム発癌機構を報告した。しかしその詳細なメカニズムの解明には至らなかった。そこで本研究では、その詳細な機構を明らかすることを目的とし我々独自のIn vitro EBV感染系を用いたオミクス解析により、その責任因子とEBV上の機能領域を同定する。更には責任因子の阻害、責任ゲノム領域の配列特異的なゲノム・エピゲノム編集による増殖抑制効果を検証する。本研究により、ウイルス感染による発癌の本態解明と新規治療戦略の基盤創出を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
Epstein-Barrウイルス(EBウイルス)が潜伏感染時にホストゲノムと直接的に相互作用することでホストヘテロクロマチンを異常に活性化するメカニズムを明らかにするため、4C-seq法によるウイルス-ホストゲノム相互作用、Hi-C法によるホストクロマチン構造、ChIP-seq法によるヒストン修飾及びウイルス因子の結合状態を統合解析を行った。ウイルスゲノム相互作用領域のうち、ヘテロクロマチンからユークロマチンへの活性化シフトを起こしている領域は、活性化クロマチンシフトを起こしていないウイルスゲノム相互作用領域と比較し、ウイルスゲノムとの相互作用頻度が高いことが明らかとなった。このことからウイルスゲノムとの相互作用そのものがヘテロクロマチン活性化に寄与していることが示唆され、ウイルスゲノム相互作用の形成に重要なウイルス因子EBNA1の関与を疑い、EBNA1 ChIP-seqの解析を行った。するとEBNA1結合レベルが高いウイルスゲノム相互作用領域ほど高頻度にクロマチンの活性化シフトを起こしていることがわかった。ウイルス因子EBNA1はヘテロクロマチンへの結合が知られるヒストンH1の結合を阻害してクロマチンの脱凝縮に関与することが報告されており、ヒストンH1が関与していると仮説を立てた。
ヒストンH1をCUT&Tag法で同定したところ、ウイルスゲノム相互作用領域において有意にヒストンH1レベルが低く、ヒストンH1と逆送還することが知られるユークロマチンマークであるヒストンH3K36me2が有意に高いことがわかった。また、ウイルス感染がこのクロマチン状態を誘導していることを解明するため、我々が有するIn vitro EBV感染系を用いてEBウイルス感染前後の比較を行ったところ、ウイルスゲノム相互作用領域において有意なヒストンH1レベルの低下とH3K36me2の上昇を確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定と異なる方向に進んでいるが、本申請計画の中で取得した様々なヒストン修飾を統合解析することでEBNA1結合によるヒストンH1の関与という新たな発見を得られた。現在この仮説を強固に証明すべく、組換えEBウイルスによる実験などを進め、EBNA1結合による影響をより詳細に解析すると共に、EBNA1共局在因子の解明を計画している。
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| Strategy for Future Research Activity |
ウイルス因子EBNA1の結合がヘテロクロマチン構造の活性化を誘導していることを確認するため、HAタグ付きのEBNA1を発言する組換えEBウイルスをバーキットリンパ腫細胞株に感染させ、EBNA1結合とヒストンH1、H3K36me2の状態を統語解析する。EBNA1と共局在するホストタンパク質を明らかにするため、EBNA1もしくはHAタグで免疫沈降を行い、EBNA1k結合因子のマス解析を行う。
また、ウイルス感染後どのようなステップで抑制的なヒストン修飾の消失と活性化ヒストン修飾の誘導が認められるのかを明らかにするため、In vitro EBウイルス感染系を用いて時系列解析を進める。特に抑制ヒストン修飾として、H3K9me3、ヒストンH1、活性化ヒストン修飾としてH3K27ac、H3K36me2の解析を進める。
最後にEBNA1結合の低下やウイルスゲノムの除去により活性化したヘテロクロマチンへの影響を明らかにするため、EBNA1のsiRNAやsRNAによるノックダウン後のヒストン修飾解析を行う。また、EBウイルス陽性細胞株からEBウイルスを除去した細胞株を用いてウイルスゲノム相互作用領域のヒストン修飾解析を行う。
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