| Budget Amount *help |
¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000)
Fiscal Year 2025: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000)
Fiscal Year 2024: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000)
Fiscal Year 2023: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000)
Fiscal Year 2022: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
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| Outline of Annual Research Achievements |
SRP再構成 について: HeLa細胞抽出液由来試験管内翻訳システムで各サブユニット（SRP9-HA, SRP14-HA, SRP19-HA, SRP54-HA, SRP68-FLAG, SRP72-HA）を発現し、T7 RNPを用いて合成したSRP RNAを混ぜインキュベートすることでSRP複合体を形成させ、SRP68に付加させたFLAG配列に対する抗体を用いて精製した。HA抗体によるwestern blotting を行うと他のすべてのsubunitが含まれていることが確認できた。
SR/Sec61のリポソームへの組み込みについて：SRPリセプター (SRa-FLAG, SRb-FLAG), Sec61複合体 (Sec61a-FLAG, Sec61b, Sec61g) をHeLa細胞抽出液由来試験管内翻訳システムで発現し、界面活性剤を添加した状態でFLAGレジンに架け、界面活性剤存在下で溶出した。そこに、リポソームを加えインキュベートした。透析により界面活性剤を抜くことで、タンパク成分の組み込みを促した。蛍光基の付いたFLAG抗体を用いて蛍光顕微鏡で観察すると、リポソームの膜が蛍光を発していた。つまりSR/Sec61がリポソームへ組み込みこまれていることを示唆している。
Signal peptidase発現について：Signal peptidaseの構成サブユニット（a, c, b,g）ををHeLa細胞抽出液由来試験管内翻訳システムで発現した。同時にSP (signal peptide)-EGFP HAも発現し、SP配列が切断されるかどうか調べたが、切断されていなかった。
CFTR発現について：CFTR全長（1480aa）をPCR templateを用いて、HeLa細胞抽出液由来試験管内翻訳システムと再構成型翻訳システムを用いて発現することに成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
SRPリセプター (SRa, SRb), Sec61複合体 (Sec61a, Sec61b, Sec61g) が組み込まれたリポソームへ、Signalペプチダーゼ複合体（Sec61a, Sec61c, Sec61b, Sec61g）を組み込んでいく。組み込みは、界面活性剤と脂質成分そしてタンパク成分を混合し、界面活性剤を透析で除去することにより行う。様々な界面活性剤や脂質成分を試すことにより組み込みを成功させる。そして、再構成翻訳系にSRPとSR-Sec61- Signalペプチダーゼが組み込まれたリポソームを添加し、SP (signal peptide)-EGFP HAを発現させる。もし、SP配列が切断された場合はリポソーム内が蛍光を発する。同時にHAによるwestern blotも行う。
そして、Sec61以外のER成分に関する因子群：Sec62, Sec63, ER関連シャペロン（ERjip, ERj2, CANX, CALR, Erp57, PDIA3）、TRAP複合体(subunit1,2,3,4)、EMC複合体（EMC subunit1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10）、PAT複合体（CCDC47, WDR83OS）、BOS複合体（NCLN, TMEM147, NOMO1）、GEL複合体（C20orf24, TMCO1）などをリポソームに組み込むため、これらの発現系を整える。また、co-translational糖鎖付加を試験管内で再構成するために、糖鎖付加酵素複合体（SSTT3a, DC2, KCP2, OST4, TMEM258, RPN2, OST48, DAD1）をクローニングしていく。
更に、CFTRをリポソーム上で発現し、塩素イオンチャネルとして機能するかどうかを検討していく。
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