| Project/Area Number |
23K23875
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| Project/Area Number (Other) |
22H02612 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43060:System genome science-related
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
今高 寛晃 兵庫県立大学, 工学研究科, 教授 (50201942)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000)
Fiscal Year 2025: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000)
Fiscal Year 2024: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000)
Fiscal Year 2023: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000)
Fiscal Year 2022: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
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| Keywords | 翻訳 / タンパク質合成 / 再構成 / 小胞体 / フォールデイング / リポソーム / シャペロン / CFTR / フォールディング / 翻訳因子 / SRP / translation / reconstitution / protein folding / cell-free |
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| Outline of Research at the Start |
リボソームにより合成（翻訳）されタンパク質が立体構造を形成することをフォールディングと呼ぶ。このフォールディングが異常を来す病：フォールディング病が多く報告されている。本研究はまず試験管内で「タンパク質の翻訳・フォールディング」を精製因子のみで再現する「再構成型翻訳・フォールディングシステム」を確立する。そして、そのシステムを用いて代表的なフォールディング病「嚢胞性繊維症」や「セルピン病」の分子論的解析を行う。
タンパク質は生命の根幹であるため本研究で開発される「再構成型翻訳・フォールディングシステム」は関連病の解析のみならず、分子生物学研究の基本的なツールとして役立つことが期待される。
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| Outline of Annual Research Achievements |
人工ER(endplasmic reticulum)構築を目指し、SRPリセプター (SRa-FLAG, SRb-FLAG), Sec61複合体 (Sec61a-FLAG, Sec61b, Sec61g)、 Sec62-FLAG/63-FLAGそしてシグナルペプチダーゼ複合体 (Signal peptidase:サブユニットa, c, b,g）をHeLa細胞抽出液由来試験管内翻訳システムで発現し、FLAGレジンで精製後、リポソームに組み込んだ。このリポソームと再構成SRPを組み合わせ、再構成型ヒト無細胞翻訳系（HumanPURE）に接続することにより、HumanPURE-ER連動システム構築を試みた。このシステムでは、SP (signal peptide)-EGFPあるいはEGFPを発現すると、SRPとSP配列存在下においてのみEGFPタンパクがリポソームに輸送された。そして上記のシステムにN-型糖鎖付加機能を持たせるため、糖鎖付加酵素複合体（STT3a:酵素本体, DC2, KCP2, OST4, TMEM258, RPN2, OST48, DAD1）を発現・精製した。活性確認として、この精製STT3a複合体はアスパラギン含有ペプチドに糖鎖を付加することが確認できた。現在、HumanPURE-ER連動システムにこの糖鎖付加酵素複合体を組み込んでいる。そして、試験管内翻訳系において機能性膜タンパク質を発現することを目標に、まずカリウムイオンチャネルであるKcsAをHeLa細胞抽出液由来試験管内翻訳システムで発現・精製した。このKcsAサンプルは、イオンチャネル機能測定器（Orbit-mini）を用いて、カリウムイオンチャネルとして機能していることが確認できた。現在、塩素イオンチャネルであるCFTRで同様の実験を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究は概ね順調に進んでいる。人工ERを作成し、ヒト因子由来再構成型翻訳システム（HumanPURE）と連結し、HumanPURE-ER連動システムを開発することが本プロジェクトの大きな目標である。それに対し、２０２４年度までに、基本的に必要な因子を調達（精製）し、それらをリポソームに組み込むことにより、人工ERの構築を進めている。また、このシステムを用いた研究として、ER内folding不全の解析を始めている。目下CFTRの試験内合成と活性（イオンチャネル活性）測定に関する実験系が構築されつつある。以上により本科研費研究は計画通りに進んでいる、と考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
2025年度は最終年度であるため、HumanPURE-ER連動システムの完成と、そのシステムを用いたCFTRやアンチトリプシン機能検定を成功させる。特に、翻訳に連動したN-型糖鎖付加機能をHumanPURE-ER連動システムに組み込み、ER内での翻訳―folding連動システムを完成させ、将来に向けた技術革新の基礎を築く予定である。N-型糖鎖付加に関しては、例として、hCG-alfa, EPO, IL5,IL6(何れも糖鎖付加が起こることが知られている)を用いて実験系設置を進める。系がうまく働いていることを示すため、糖鎖切断酵素による確認、または糖修飾が起こるアミノ酸残基であるAsnをAspに変異させたタンパク質を発現させる。また、糖鎖付加機能と共に、シグナル配列切断機能も観察する。CFTRを試験管内で合成しリポソームに組み込む方法はSec61を組み込んだ時の方法を用いる。CFTRは大部分が細胞質側に存在し細胞質のシャペロンとの相互作用が重要と考えられるため、系にシャペロンを投入しながら翻訳する。
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