| Project/Area Number |
23K23882
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| Project/Area Number (Other) |
22H02619 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 44010:Cell biology-related
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
柳谷 耕太 大阪大学, 大学院生命機能研究科, 准教授 (70614775)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000)
Fiscal Year 2025: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000)
Fiscal Year 2024: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2022: ¥6,630,000 (Direct Cost: ¥5,100,000、Indirect Cost: ¥1,530,000)
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| Keywords | オルガネラ / みなしごサブユニット / みなしごサブユニットの品質管理 / ミトコンドリア / 翻訳制御 / ユビキチン化 / タンパク質の品質管理 / 核-ミトコンドリアコミュニケーション |
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| Outline of Research at the Start |
ヒトの細胞では約50％のタンパク質が、複数のサブユニットからなる複合体として存在するが、複合体に入れなかったみなしごサブユニットは分解される傾向にある。みなしごサブユニットの蓄積は細胞毒性を示す場合があり、その処理機構は細胞の恒常性にとって重要である。しかし、哺乳動物細胞がどのように、みなしごサブユニットを取り扱うのかについては十分に理解されていない。本研究では、ミトコンドリアのタンパク質複合体である呼吸鎖複合体とミトコンドリアリボソームに着目し、そのみなしごサブユニットを蓄積させない仕組みを明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質複合体は、定まった化学量論比で成り立っており、複合体に入れなかったサブユニットは、みなしごサブユニットとなる。最近、ヒト細胞のタンパク質の安定性がプロテオームレベルで調べられた結果、みなしごサブユニットと推察される一群のタンパク質(全プロテオームの約7%)が、速やかに分解されると報告されている(MacShene, Cell, 2016, PMID: 27720452)。これは、みなしごサブユニットの蓄積は有害であるため、細胞は速やかにこれらを見つけて分解し、恒常性を維持していることを示唆している。しかし、みなしごサブユニットがどのように取り扱われているかについては、研究が進んでいない。本研究では、ミトコンドリアのタンパク質複合体である呼吸鎖複合体（Respiratory Chain Complex: RCC）とミトコンドリアリボソームに着目し、そのみなしごサブユニットを蓄積させない仕組みの解明を目指している。
2022年度までの解析では、ミトコンドリアを人為的に減少させ、サイトゾル由来のRCCサブユニットの供給量をミトコンドリア由来のRCCサブユニットの供給量に対して過剰にした状況下では、ミトコンドリア内遺伝子発現が活性化する可能性が示唆されている。2023年度では、その可能性の検証を行う。また、ミトコンドリア内で複合体を形成するミトコンドリアリボソームの一部のサブユニットが、サイトゾルに長期滞留して、みなしごサブユニットになった場合には、高度にユビキチン化されることが明らかになった。2022年度には、このユビキチン化を引き起こす候補因子をすでに同定できているので、2023年度には、この因子が担う、ミトコンドリア関連のみなしごサブユニットの品質管理の意義を明らかにする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
RCCは、ミトコンドリア内部で合成される13個のサブユニットと、サイトゾルで合成されてミトコンドリア内部に移行されるサブユニットから構成されている。そのため、両区画からのバランスの取れたサブユニット供給は、みなしごサブユニットを発生させないためにも重要である。我々の研究で、ミトコンドリアを人為的に減少させて、ミトコンドリア側のRCCサブユニット供給量を不足状態にした場合、統合ストレス応答 (ISR)が活性化されることが分かってる。このISRの役割を明らかにするために、ISRの阻害の有無で、減少したミトコンドリア量を回復させると、ISR依存的に、ミトコンドリアタンパク質群の一部が回復することが明らかになった。これらのタンパク質をGene ontology解析をすると、ミトコンドリア内転写を担うタンパク質や、ミトコンドリアリボソームタンパク質やミトコンドリアリボソームの成熟を担うタンパク質などの、ミトコンドリア内での遺伝子発現に関連した因子群がISR依存的に回復することが明らかになった。興味深いことに、それらのタンパク質発現上昇は、転写後のイベントであることが明らかになっている。
RCCやミトコンドリアリボソームは、ミトコンドリア内部で会合するので、サイトゾルで合成されたサブユニットは、ミトコンドリアに移行できなくなった場合、サイトゾルでみなしごサブユニットとなる。このようなサイトゾルにおける、ミトコンドリアみなしごサブユニットが細胞にどのように処理されるのかを明らかにするために、ミトコンドリアリボソームタンパク質 (mt-RPs)を、ウサギ網状赤血球抽出液を用いて試験管内翻訳すると、高度にユビキチン化されるmt-RPを見出した（mt-RPXとする）。このユビキチン化を担う候補因子（E3Yとする）もその相互作用因子から見出している。
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| Strategy for Future Research Activity |
ミトコンドリア量が回復する過程で、ミトコンドリア内での遺伝子発現が、ISR依存的に促進されていることが示唆されている。そのため、遺伝子発現を、転写と翻訳に分けて、解析する。転写については、ウリジンの類似体である4-thiouridineを取り込ませて、新規に合成された転写産物を標識する。そして、その精製産物を基に、ミトコンドリアDNAにコードされる遺伝子の存在量を定量PCRで解析する。翻訳については、メチオニンの類似体であるL-Homopropargylglycineを取り込ませ、新規に合成されたタンパク質を取り込ませ、精製後、ミトコンドリアで合成されたRCCサブユニットとサイトゾルで合成されたRCCサブユニットの比率を比べ、ISRに依存したバランス調整が存在するのかを検証する。ミトコンドリア不足時に、ミトコンドリア内にみなしごサブユニットが発生していることが示唆されているが、それをBlue-Native PAGEで解析する。
mt-RPXのユビキチン化に対するE3Yの影響を検証する。mt-RPXのユビキチン化は、HeLa細胞にFCCP処理をして、mt-RPXをサイトゾルに蓄積させた場合でも確認できている。そのため、E3Yの発現を抑制させた場合に、mt-RPXのユビキチン化が減少するのかを検証する。みなしごmt-RPXのユビキチン化責任因子としては、もう一つの候補（E3Zとする）も得られているので、もし、E3Yの抑制のみで効果がない場合は、E3Zの抑制との組み合わせで、mt-RPXのユビキチン化に対する影響を検証する。これらの解析で、みなしごmt-RPXに対するユビキチン化因子が同定できれば、みなしごmt-RPXを蓄積させた場合に、細胞の機能がどのように悪影響を受けるのかを検証する。
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Report
(1 results)
Research Products
(2 results)
