| Project/Area Number |
23K23909
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| Project/Area Number (Other) |
22H02646 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 44030:Plant molecular biology and physiology-related
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
荒木 崇 京都大学, 生命科学研究科, 教授 (00273433)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000)
Fiscal Year 2024: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥5,850,000 (Direct Cost: ¥4,500,000、Indirect Cost: ¥1,350,000)
Fiscal Year 2022: ¥7,410,000 (Direct Cost: ¥5,700,000、Indirect Cost: ¥1,710,000)
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| Keywords | 精細胞 / 父性ゲノム / 配偶子機能 / 制御モジュール / ゼニゴケ / シロイヌナズナ |
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| Outline of Research at the Start |
基部陸上植物ゼニゴケを用いて、精細胞が雄性生殖細胞としての機能を獲得するための制御モジュールを明らかにすることを目指す。特に、精細胞分化のマスター制御因子DUO1の下流の転写因子RWP1による、(1)完全性と安定性を維持しつつ父性ゲノムを伝達するための機構、(2)受精後の胚(胞子体）発生を可能にするための機構、の二つを司る制御モジュールに着目し、陸上植物における精細胞分化の全体像の理解を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究項目１ RWP1-Citrine knock-in株, 野生型Tak-1株, rwp1変異株とその相補株, daz1変異株とその相補株から造精器を摘出してRNAseq解析をおこない、遺伝子発現データを得た。RWP1-Citrine knock-in株から得たCitrine蛍光ポジティブの造精器の結果と大きさにより判断した野生型株の後期造精器の結果は概ねよく一致し、発生ステージの判別が大きさによって適切におこない得ることが確認できた。被子植物ではこれまで全く見落とされていたRWP1および精細胞特異的と考えられるH1バリアント遺伝子の変異体の作出と解析をおこなった。両遺伝子の変異体で雄特異的な稔性の低下が確認され、精細胞機能における重要性が示唆された。しかし、精細胞核の異常所見は得られていない。精細胞特異的な small RNA経路に関しては、第６染色体に座乗するPHAS遺伝子座の完全欠失変異体を得て表現型解析を進めている。精細胞特異的なDNAメチル化酵素遺伝子DN4MT1A,Bの完全欠失変異体との多重変異体の作出も進めている。small RNAの3’末端メチル化酵素 HEN1については、共同研究により生化学的な活性の確認、抗体の特異性の確認をおこない、造精器特異的なアイソフォームの発現を低下させる変異体の作出を進めている。
研究項目２ KNOX1遺伝子座の発現抑制に関しては、SUK1プロモータ上のRWP1結合モチーフを欠失させ、SUK1の発現が低下し、KNOX1を発現する変異体を２株取得した。KNOX1A遺伝子欠失変異やBELL3/4/6遺伝子多重欠失変異の作出などをおこなった。精細胞特異的な選択的スプライシングの制御に関して、RWP1-Citrine knock-in株を用いた精細胞分化期の造精器の Iso-seq解析のためのRNA試料調製などをおこなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究項目１ 今年度後半のRNAseqにより、精細胞形成に関わる転写因子DUO1, RWP1, DAZ1に関して、後期造精器のChIPseq（DAZ1を除く）、野生型vs変異体vs相補株を比較したRNAseqの結果が揃うことになった。予備的な解析から、DUO1とその制御下の２つの転写因子RWP1とDAZ1による遺伝子発現制御に関して興味深い知見が得られつつある。DAZ1-Citrine knock-in株を得ており、DAZ1に関しても ChIPseqをおこなう目処がたった。これらは期待通りの進捗である。被子植物でこれまで全く見落とされていたRWP1および精細胞特異的H1バリアント遺伝子については、シロイヌナズナで両遺伝子の機能喪失変異体を得て、雄特異的な稔性の低下を見出すことができたのは、大きな進捗であったが、既報の h2b.8変異体を含めて、精細胞核表現型の確認と発現制御に関する解析の完了が残る課題である。精細胞特異的な small RNA経路に関しては、国際共同研究による生化学的な解析を含めて、種々の解析の準備が順調に進んでいる。DN4MT1A, B遺伝子については、精細胞特異的なphasiRNAとの関連で解析を再開した。
研究項目２ RWP1による精子側因子BELL3, 4の発現促進と逆鎖からの lnc RNA転写(SUK1)を介した卵側因子KNOX1の発現抑制については、SUK1の発現低下による KNOX1の異所発現を確認できた。lnc RNA と考えていたSUK1について、そのORFにコードされるタンパク質（SUK1p）が成熟精子のプロテオーム中に検出されることを見出し、転写は起こるがSUK1pを生じない変異体の作出をおこなった。RWP1依存に精細胞特異的に発現するBELL6遺伝子を見出し、BELL3/4/6の相互作用因子候補のKNOX1Aとともに解析に着手した。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまで、複数の論文・総説で、被子植物にはゼニゴケのRWP1に対応するサブファミリーのRWP-RK転写因子遺伝子は存在しないとされてきた。また、ヒストンH1についても被子植物におけるバリアントの報告は限定的で、コケ植物や動物のような精細胞特異的なバリアントは知られていない。これまでの研究の過程で、被子植物にもそれら（RWP1, H1sp）が存在することを見出し、昨年度はシロイヌナズナの精細胞におけるそれらの重要性の一端を明らかにしつつある。被子植物特異的なH2Bバリアント（H2B.8）がシロイヌナズナの精細胞における核の圧縮に関わるという報告が2022年11月に出ており、昨年度は、野生型と変異体の三核期の花粉を含む花を用いた予備的な解析から、シロイヌナズナではH1spとH2B.8の発現はRWP1による制御を受ける可能性の検証を進めた。これらから、DUO1→RWP1→精細胞特異的ヒストンバリアント→精細胞核の凝縮あるいは圧縮というモジュールが、コケ植物（ゼニゴケ）と被子植物（シロイヌナズナ）の間で保存されており、雄性配偶子機能に重要であることが推察される。最終年度の今年度はそれらを論文としてまとめる。
精細胞特異的な small RNA経路、RWP1による精子側因子BELL3/4/6と卵側因子KNOX1の発現調節、RWP1依存の精細胞特異的な転写開始点選択、DUO1依存の精細胞特異的な選択的スプライシングの制御について、計画どおり研究を進める。
一昨年度に得たDUO1とRWP1のChIP seqデータや以前に得ていた duo1変異体の後期造精器のRNAseqデータに加えて、昨年度末に、rwp1, daz1変異体の後期造精器のRNAseqデータを得ることができた。今年度は、それらをもとに精子形成過程の転写制御ネットワークの大まかな枠組みに関する知見を得る。
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