| Project/Area Number |
23K23932
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| Project/Area Number (Other) |
22H02669 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 45010:Genetics-related
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| Research Institution | National Institute of Genetics |
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Principal Investigator |
齋藤 都暁 国立遺伝学研究所, 遺伝メカニズム研究系, 教授 (30423396)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000)
Fiscal Year 2024: ¥5,200,000 (Direct Cost: ¥4,000,000、Indirect Cost: ¥1,200,000)
Fiscal Year 2023: ¥5,330,000 (Direct Cost: ¥4,100,000、Indirect Cost: ¥1,230,000)
Fiscal Year 2022: ¥6,890,000 (Direct Cost: ¥5,300,000、Indirect Cost: ¥1,590,000)
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| Keywords | piRNA / エピゲノム / ショウジョウバエ / トランスポゾン / 分子機構 / レトロトランスポゾン / ヒエラルキー / 培養細胞 / 生化学 / 生殖細胞 / 生合成 / 小分子RNA |
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| Outline of Research at the Start |
レトロトランスポゾンはゲノム内を転移する能力を持つ寄生性DNA因子であるが、これはゲノムから排除されず、世代を越えて保持される。しかし、レトロトランスポゾンの転移は、生物の次世代継承にとって脅威となるため、その発現は抑制されている。本研究はレトロトランスポゾンの発現抑制に重要な仕組みの一つであるpiRNA経路について、その詳細なメカニズムをモデル動物ショウジョウバエと培養細胞を駆使して明らかにするものである。本研究過程で、新規関連因子群の同定を果たすとともにその詳細な分子機能を解明する。さらに新規因子と既知因子群との上下関係を生化学的、遺伝学的に明らかにすることで詳細なメカニズム解明を果たす。
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| Outline of Annual Research Achievements |
piRNAは主に生殖細胞で特異的に発現する一方で、体細胞ではその発現が抑制状態にある。この細胞特異的な制御にLethal (3) malignant brain tumor (L(3)mbt)と呼ばれるDNA結合タンパク質が関与することが分かっているが、その作用メカニズムの詳細は不明である。これまでに、L(3)mbtと協調して働く新規遺伝子CG2662を同定し、Lint-Oと名付け、論文報告した(EMBO reports, 2022)が、2023年度は、piRNA制御経路における最下流の作用機構解明を目指して以下の研究を実施した。
(1) SovおよびCG31510の分子機能解明
卵巣性体細胞株OSCにおいて同定したレトロトランスポゾン抑制因子、Sovの機能解明を進めた。これは2000アミノ酸残基以上から成るタンパク質で非常に検出が困難であった。これまでに作成したマウスモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット法を改良し、Sovを安定的に検出可能な実験条件の同定に成功した。これは論文報告する上で重要なステップであり、今後の相互作用タンパク質同定や分子機序解明にも役立つと考えられた。
(2)分子ヒエラルキーの解明
レトロトランスポゾン抑制に必要なSov内のタンパク質領域を決定するため、Sovの過剰発現系の開発を目指した。発現ベクターにSovのcDNAを導入したが、残念ながらSovの発現が認められなかった。FlagタグをN末端、またはC末端側に導入したプラスミドを作出したが発現が認められなかった。したがって、Sovの分子機能や機序を探索する手法としてプラスミドベクターを用いた手法には限界があることが分かった。
以上の結果からSovの分子機能解明には内在性のタンパク質を材料とした実験手法を用いるのが最適と考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでの研究から、L(3)mbtと協調して働く新規遺伝子CG2662を同定し、Lint-Oと名付け、論文報告しており、おおむね順調に研究が進展している(EMBO reports, 2022)。現在、レトロトランスポゾン抑制因子Sovの機能解明に注力しているが、核内に存在する巨大タンパク質であることなどが原因で解析が進んでいない。piRNA経路因子は多数報告されているが、その中でもSovの分子サイズはもっとも大きく、解析には困難が伴うものと予測される。しかし、巨大タンパク質であるがゆえに、piRNAによるレトロトランスポゾンの抑制機構と分子ヒエラルキーにおいて中枢を担うタンパク質であるとも考えられるため今後も継続して実験系の改良を果たしたい。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまで同定したレトロトランスポゾン抑制に働く新規因子Sovの機能解明を通してpiRNA経路の下流機構解明と分子ヒエラルキーの解明を果たす。
(計画1) Sovの分子機能解明
これまで研究代表者は、Sov/CG14438タンパク質が培養細胞OSCにおいてレトロトランスポゾンの抑制に機能することを見出している。Sovに結合する核酸や蛋白質を同定し、さらにクロマチン免疫沈降と次世代シーケンサーによる解析(ChIP-seq)により、相互作用ゲノム領域の特定を行う。この実験はマウスモノクローナル抗体を駆使するが、もし実験的に困難と判断された場合は、別の抗体の活用も検討する。具体的には、CRISPR/Cas9と相同遺伝子組換えを利用して、SovのN末端、もしくはC末端にFlagタグなどのタグ配列を付加したゲノム改変OSCを作出し、これを利用する。
(計画2)分子ヒエラルキーの解明
Sovを中心としてこれまで報告されたpiRNA抑制因子群がレトロトランスポゾン抑制においてどのような位置づけで機能するか、解明する。OSCで各因子をノックダウンし、SovのDNAへの相互作用やヒストンマークの解析、タンパク質間相互作用の依存性を免疫沈降解析を通じて理解する。
以上の解析結果を統合して、レトロトランスポゾン抑制因子群の分子ヒエラルキーについて新しいモデルを提示する。
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