| Project/Area Number |
23K24013
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| Project/Area Number (Other) |
22H02750 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 47020:Pharmaceutical analytical chemistry and physicochemistry-related
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
岩崎 憲治 筑波大学, 生存ダイナミクス研究センター, 教授 (20342751)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹中 聡 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪国際がんセンター(研究所), その他部局等, 整形外科部長 (00588379)
堀越 直樹 東京大学, 定量生命科学研究所, 准教授 (60732170)
吉田 将人 筑波大学, 数理物質系, 准教授 (80511906)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,290,000 (Direct Cost: ¥13,300,000、Indirect Cost: ¥3,990,000)
Fiscal Year 2024: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
Fiscal Year 2023: ¥5,720,000 (Direct Cost: ¥4,400,000、Indirect Cost: ¥1,320,000)
Fiscal Year 2022: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000)
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| Keywords | 滑膜肉腫 / 創薬 / 構造解析 / 構造生物化学 |
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| Outline of Research at the Start |
滑膜肉腫は、染色体転座によって生じるSS18-SSXがドライバー遺伝子であることが知られているにも関わらず、化学療法の確立していない希少 がんである。腫瘍発生につながる転写異常をSS18-SSXが引き起こすわけであるが、その作業仮説として提案されている3つのモデルの検証に挑 む。例えば、SS18-SSXとヌクレオソームの相互作用がトリガーとなるというモデルである。この目的のために、世界で初めて我々が成功した完全長SS18-SSXの精製タンパク質やSSXフラグメントの精製タンパク質を用いた各因子間の相互作用様式の解明、その親和性の定量解析、構造解析を最先端の技術を用いて行う。加え て各モデルに基づいた阻害剤の候補化合物を合成する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
現在最も受け入れられ、コンセンサスの得られているKadochモデルの検証に予定通り取り組んだ。SS18-SSXのC末端領域と酸性パッチとの相互作用解析を行った。特に患者の2／3を占めるSS18-SSX1だけでなく残り1／3の患者から検出されるSS18-SSX2も考慮して実験を行った。本結果から、ヌクレオソームのH2A K119ユビキチン化がなくても、弱いながら相互作用することが判明した。実際GraFixという手法によって、複合体のクライオ電子顕微鏡単粒子解析に成功した。SSX1、SSX2両者のC末端領域と野生型クロマチンリモデリング複合体SWI/SNFの正常成分SMARCB1の酸性パッチ結合領域であるC末端25アミノ酸残基の3つのヌクレオソームに対する親和性の大きさの比較をプルダウンアッセイ法で行った。ただし、SSX1とSSX2については、SS18-SSXに含まれる78残基とC末端の酸性パッチ結合領域34残基の2種類について本実験を行った。この結果からSMARCB1がSS18-SSXによってSWI/SNF複合体に結合できなくなることが証明されたが、その詳細なメカニズムは原子モデルを用いた検討が必要である。また、Nielsenらが提唱しているモデルを検証するため、そして阻害剤の検討をするためHDAC２の発現および精製に取り組んでいたが、バキュロウイルス発現系の構築に失敗が続き、試したコンスラクトについて、ことごとく発現さえ認められないという結果であった。そこでExpi293Fを用いた発現系を試し、発現が認められたが、Expi293FでHDAC2を発現した場合に大きな問題があることが見つかった。幸いにもExpi293Fの実験を通じてバキュロウイルス発現系におけるこれまでの問題点が明らかになり、新たにバキュロウイルスを用いた昆虫細胞発現系のデザインを考案するに至った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の想定に反し、HDAC2の 発現精製に 際して、バキュロウイルスを用いた昆虫細胞発現系構築に失敗し、続いて行ったExpi293F細胞培養発現系での取組のおいて、試薬 にHDAC2の強力な阻害剤が含まれていることが判明したから。
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| Strategy for Future Research Activity |
SSX1RD-ヌクレオソームとSSX2RD-ヌクレオソーム複合体のクライオ電子顕微鏡単粒子解析結果から原子モデルを構築し、詳細な結合様式を調べる。また、その結果を既報告のSWI/SNF－ヌクレオソーム複合体の構造におけるSMRACB1とヌクレオソーム酸性パッチとの相互作用様式と比較する。これによって、2022年度の研究結果得られたヌクレオソーム酸性パッチに対する結合親和性の大きさの違いの説明を試みる。一方で、分子レベルの、SSX1とH2A-H2Bヘテロダイマーの結合阻害アッセイ系を改良し、完成させる。同時にSSX2とH2A-H2Bヘテロダイマーの結合阻害アッセイ系を作製する。これによって、結合親和性のある程度の定量化をこころみる。また、患者細胞を用いて、吉田将人博士の作製した化合物の細胞毒性を検証する。HDAC2のバキュロウイルス発現系の構築、精製に成功したら、HDAC2阻害剤のHDAC2阻害アッセイを行う。
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