合成生物学的手法を基盤とする活性天然物の構造展開研究

• Project/Area Number: 23K24038
• Project/Area Number (Other): 22H02775 (2022-2023)
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund (2024); Single-year Grants (2022-2023)
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 47050:Environmental and natural pharmaceutical resources-related
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 浅井 禎吾 東北大学, 薬学研究科, 教授 (60572310)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000); Fiscal Year 2025: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2024: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2023: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2022: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
• Keywords: 天然物 / 生合成 / ゲノムマイニング / 合成生物学 / 薬理活性天然物 / 糸状菌 / 構造展開

Outline of Research at the Start

本研究では、天然に存在する生合成経路を異種ホストで再構築し、それらの機能を解析するとともに、そこで得られた基質認識や反応機構をもとに、新しい生合成経路を設計し、異種ホスト内で構築することで、天然にはプログラムされていない天然物の創製を目指す。また、様々な生物種の天然物修飾酵素遺伝子をランダムに作用させるシステムを構築することで、天然物の多様性を拡張する手法を構築する。

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、本研究の骨格の部分の異種生産系の構築に重点をおいて進めた。
まず、麹菌を宿主として、植物テルペノイドの生産プラットフォームの構築を試みた。グリチルリチンは、生薬カンゾウに含まれる主要なトリテルペン配糖体であり、生合成遺伝子が明らかにされている。また、酵母での異種生産は達成されているが、糸状菌の修飾酵素と組み合わせたコンビナトリアル生合成を達成するためには、糸状菌での異種生産が必要である。そこで、グリチルリチン生合成に関与する、麹菌にコドンを最適化したテルペン環化酵素であるβ-アミリン合成酵素を導入した麹菌形質転換株を作製した。その結果、期待通りβ-アミリンの生産を確認することができた。次に、β-アミリンからグリチルレチン酸への変換を担うP450とCYP還元酵素をそれぞれ麹菌にコドンを最適化して追加導入した形質転換株を作製した。種々の培養法や抽出法を検討したが、グリチルレチン酸の生産は、LC-MSでは検出することはできなかった。酵母の異種生産での文献を精査したところ、配糖化する前のアグリコンではほとんど化合物の蓄積が観測されなかったが、糖転移酵素を導入し、配糖化された化合物で初めて蓄積されていたことが判明したため、現在、配糖化酵素および原料糖であるUDPグルクロン酸合成酵素をそれぞれ麹菌にコドン最適化したものを導入している。
糸状菌のジテルペン骨格の異種生産系については、順次構築を進めている。また、フラボノイドの麹菌での異種生産系も順次構築を進めている状況である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

糸状菌をホストとして、植物の代表的なトリテルペンであるβ-アミリンの生合成に成功した。このことは、糸状菌において、様々な植物トリテルペンを生産できることを示唆する結果である。一方で、標的としてグリチルレチン酸の生産は確認できておらず、植物天然物の糸状菌での生産を達成するには、より多くのトライアンドエラーが必要であることもわかった。
また、本研究で用いる骨格となる糸状菌テルペン類に関しては、順次異種生産系を構築が進んでおり、また、植物の主要な天然物であるフラボノイド類に関して、糸状菌のフラボノイドの生合成研究が予想以上に進展しており、それらをプラットフォームとすることで、様々なフラボノイド類が生産できることが期待される。以上、本研究を進めていくための基盤は順調に構築できている。

Strategy for Future Research Activity

本研究で次に必要となるのは、多様な遺伝子を組み込むためのゲノム編集法である。収集した様々な修飾酵素遺伝子を１コピーを導入し、糸状菌を用いてクローニングする手法の開発を試みる。具体的には、遺伝子断片を用いて、糸状菌ゲノム上に直接遺伝子断片をクローニングするゲノム編集法の最適化を実施する。それにより、収集した多様な修飾酵素遺伝子を混合して同時に形質転換することができ、麹菌内でクローニングし、コロニーを培養し、代謝物を分析することで、代謝物に変化したコロニーをピックアップして、その株についてシーケンスすることで、導入された酵素遺伝子を特定するというスキームが確立できる。そのため、次年度では、遺伝子導入法についても検討する予定である。
また、骨格として着目しているepidithiodiketopiperadine (ETP) については、未だ異種生産が達成できていないため、そちらについては、様々な組み合わせでの異種発現を検討し、ETP骨格を生合成するのに必要な情報を収集する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Griffith Institute for Drug Discovery/Griffith University/Nature Bank(オーストラリア)
• [Journal Article] A new 3, 6-dialkyl-α-pyrone produced by the heterologous expression of a PKS-NRPS hybrid enzyme derived from a Pestalotiopsis endophyte (2023)
  • Author(s): Y. Shi, T. Ozaki, A. Sugawara, Y. Morishita, Y.-P. Tan, R. G. Shivas, R. A. Davis, T. Asai
  • Journal Title: Tetrahedron. Lett. Volume: 134 Pages: 154865-154867
  • DOI: 10.1016/j.tetlet.2023.154865
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Identification and Functional Characterization of Fungal Chalcone Synthase and Chalcone Isomerase (2023)
  • Author(s): Furumura Sho、Ozaki Taro、Sugawara Akihiro、Morishita Yohei、Tsukada Kento、Ikuta Tatsuya、Inoue Asuka、Asai Teigo
  • Journal Title: Journal of Natural Products Volume: 86 Issue: 2 Pages: 398-405
  • DOI: 10.1021/acs.jnatprod.2c01027
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] グリチルリチン生産を目的としたβ-アミリン麹菌異種生産系の構築 (2024)
  • Author(s): 平林薫歩、尾﨑太郎、森下陽平、菅原章公、浅井禎吾
  • Organizer: 日本薬学会第144年会
• [Presentation] Vinigrolの生合成に関与する新規テルペン環化酵素の発見と機能解析 (2024)
  • Author(s): 佐藤史都、塚田健人、古村翔、森下陽平、菅原章公、尾﨑太郎、浅井禎吾
  • Organizer: 日本農芸化学会 2024年度大会
• [Presentation] 抗腫瘍活性ジテルペンmyrocin類の生合成遺伝子クラスターの同定 (2024)
  • Author(s): 藤木 竣大、佐藤 史都、園原 照隆、森下 陽平、菅原 章公、尾﨑 太郎、浅井 禎吾
  • Organizer: 日本薬学会第144年会
• [Presentation] 生物活性ジテルペンの構造展開を指向したフッ素化ドラベラン骨格の化学酵素合成 (2024)
  • Author(s): 関谷 光留、佐藤 史都、菅原 章公、森下 陽平、尾﨑 太郎、浅井 禎吾
  • Organizer: 日本薬学会第144年会,
• [Presentation] 麹菌を宿主とするin vivoクローニング法による天然物生合成経路の迅速再構築の検討 (2023)
  • Author(s): 青木翔吾, 尾﨑太郎, 菅原章公，森下陽平，浅井禎吾
  • Organizer: 第22回糸状菌分子生物学コンファレンス
• [Presentation] 麹菌を宿主とするグリチルリチン生産系の構築 (2023)
  • Author(s): 平林薫歩、尾﨑太郎、森下陽平、菅原章公、浅井禎吾
  • Organizer: 第62回 日本薬学会 東北支部大会
• [Presentation] C-F結合を利活用した非天然型ドラベランジテルペンの化学酵素合成 (2023)
  • Author(s): 関谷光留、菅原先生、森下陽平、尾﨑太郎、浅井禎吾
  • Organizer: 香料・テルペンおよび精油化学に関する討論会
• [Presentation] ゲノムマイニングによる新規カルコン合成酵素の発見 (2023)
  • Author(s): 古村 翔, 尾﨑 太郎, 森下 陽平, 塚田 健人, 生田 達也, 井上 飛鳥, 浅井 禎吾
  • Organizer: 第24回 天然薬物の開発と応用シンポジウム
• [Presentation] 糸状菌フラボノイド クロロフラボニン生合成機構の解析と異種生産 (2023)
  • Author(s): 古村翔，尾﨑太郎, 菅原章公，森下陽平，浅井禎吾
  • Organizer: 日本生薬学会第69回年会
• [Presentation] Chemoenzymatic synthesis of fluorinated dolabellane skeleton for expanding structural diversity (2023)
  • Author(s): Hikaru Sekiya, Akihiro Sugawara, Yohei Morishita, Taro Ozaki, and Teigo Asai
  • Organizer: 令和5年度化学系学協会東北大会および日本化学会東北支部80周年記念国際会
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Studies on the biosynthesis of hymeglusin, an HMG-CoA synthase inhibitor with a unique β-lactone ring (2023)
  • Author(s): Mizuki Hirokawa, Akihiro Sugawara, Yohei Morishita, Kento Tsukada Taro Ozaki, and Teigo Asai
  • Organizer: 令和5年度化学系学協会東北大会および日本化学会東北支部80周年記念国際会
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Isolation and structure elucidation of shunt products from vinigrol cyclization pathway for understanding its diterpene-skeleton formation (2023)
  • Author(s): Fumito Sato, Yohei Morishita, Kento Tsukada, Syo Furumura, Akihiro Sugawara, Taro Ozaki, Teigo Asai
  • Organizer: 8 th Taiwan-Japan Joint Symposium for Pharmaceutical Sciences, Taipei, Oral presentation
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Genome Mining of Fungal Natural Products (2023)
  • Author(s): Teigo Asai
  • Organizer: 2nd Japanese German Symposium on Natural Product Biosynthesis
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 未利用遺伝子資源を活用する天然物探索研究 (2023)
  • Author(s): 浅井禎吾
  • Organizer: 2023年学術変革領域 予知生合成科学 若手合宿勉強会
  • Invited
• [Presentation] ゲノムマイニングと異種発現を基盤とする糸状菌の天然物探索研究 (2023)
  • Author(s): 浅井禎吾
  • Organizer: 日本生薬学会第６９回年会－シンポジウム「微生物からのモノトリ研究」
  • Invited
• [Presentation] ゲノムマイニングを基盤とする天然物探索研究 (2023)
  • Author(s): 浅井禎吾
  • Organizer: 第24回天然薬物の応用と開発シンポジウム－シンポジウム「未利用微生物資源へのアプローチ」
  • Invited
• [Presentation] Biosynthetic study of an HMG-CoA synthase inhibitor hymeglusin using heterologous expression system (2023)
  • Author(s): 廣川瑞樹、森下陽平、塚田健人、菅原章公、尾﨑太郎、浅井禎吾
  • Organizer: 日本薬学会 第143年会、国際交流シンポジウム (次世代薬学アジアシンポジウム)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 糸状菌Chaetomium indicumが産生する芳香族ポリケタイドchaetophenol類の生合成研究 (2023)
  • Author(s): 松井 洸人、塚田 健人、菅原 章公、尾﨑 太郎、浅井 禎吾
  • Organizer: 日本薬学会 第143年会
• [Presentation] Vinigrolの生合成におけるジテルペン環化酵素の同定と機能解析 (2023)
  • Author(s): 佐藤史都、森下陽平、塚田健人、古村翔、菅原章公、永田隆平、葛山智久、尾崎太郎、浅井禎吾
  • Organizer: 日本薬学会 第143年会
• [Presentation] ε-ラクタム構造を有するpestalactam類の生合成研究 (2023)
  • Author(s): 石 悦、菅原 章公、尾﨑 太郎、浅井 禎吾
  • Organizer: 日本薬学会 第143年会
• [Presentation] Atranone類およびMyrocin類の生合成におけるジテルペン環化酵素の機能解析 (2022)
  • Author(s): 佐藤史都、園原照隆、森下陽平、菅原章公、尾崎太郎、浅井禎吾
  • Organizer: 第61回日本薬学会東北支部大会
• [Presentation] Chaetophenol類の生合成研究 (2022)
  • Author(s): 松井洸人、塚田健人、青木優、菅原章公、尾﨑太郎、浅井禎吾
  • Organizer: 第61回日本薬学会東北支部大会
• [Presentation] Vinigrolの生合成に関する研究 (2022)
  • Author(s): 佐藤史都、森下陽平、塚田健人、古村翔、菅原章公、永田隆平、葛山智久、尾崎太郎、浅井禎吾
  • Organizer: 第9回食品薬学シンポジウム
• [Presentation] ε-ラクタム構造を有するpestalactam類の生合成に関する研究 (2022)
  • Author(s): 石悦, 菅原章公, 尾﨑太郎, 浅井禎吾
  • Organizer: 第9回食品薬学シンポジウム
• [Presentation] 古村翔、森下陽平、塚田健人、菅原章公、尾﨑太郎、浅井禎吾 (2022)
  • Author(s): 第二のカルコン合成酵素の発見と糸状菌フラボノイド生合成に関する研究
  • Organizer: 第64回天然有機化合物討論会
• [Presentation] 19.Discovery of fungal depsipeptide based on a synthetic biology-based approach (2022)
  • Author(s): Yuto Homma, Akihiro Sugawara, Yohei Morishita, Kento Tsukada, Taro Ozaki, Teigo Asai
  • Organizer: Directing Biosynthesis VI
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 糸状菌遺伝子資源を活用する天然物探索研究 (2022)
  • Author(s): 浅井禎吾
  • Organizer: 第42回糸状菌遺伝子研究会
  • Invited
• [Presentation] 合成生物学を基盤とする天然物の構造展開研究 (2022)
  • Author(s): 浅井禎吾
  • Organizer: BINDSシンポジウム
  • Invited