comprehensive search for expanded repeats in neurodegenerative diseaess

• Project/Area Number: 23K24085
• Project/Area Number (Other): 22H02823 (2022-2023)
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund (2024); Single-year Grants (2022-2023)
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 48040:Medical biochemistry-related
• Research Institution: International University of Health and Welfare
• Principal Investigator: 辻 省次 国際医療福祉大学, ゲノム医学研究所, 教授 (70150612)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 池内 健 新潟大学, 脳研究所, 教授 (20372469) ; 田中 真生 国際医療福祉大学, 医学部, 講師 (30774252) ; 石浦 浩之 岡山大学, 医歯薬学域, 教授 (40632849) ; 三井 純 東京大学, 医学部附属病院, 特任准教授 (70579862)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥17,160,000 (Direct Cost: ¥13,200,000、Indirect Cost: ¥3,960,000); Fiscal Year 2024: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000); Fiscal Year 2023: ¥5,460,000 (Direct Cost: ¥4,200,000、Indirect Cost: ¥1,260,000); Fiscal Year 2022: ¥8,320,000 (Direct Cost: ¥6,400,000、Indirect Cost: ¥1,920,000)
• Keywords: 伸長リピート配列 / ロングリードシーケンスア / アルツハイマー病 / 神経変性疾患 / ロングリードシーケンス

Outline of Research at the Start

本研究では，封入体形成が病理学的特徴である神経変性疾患に着目して，非翻訳領域のリピート伸長配列を探索し，発症機構を解明することを目的とする．extreme phenotypeを示す神経変性疾患症例について，long read sequencer による全ゲノムシーケンス解析を実施し，独自に開発したプログラムを用いて，遺伝子の非翻訳領域に存在する伸長リピート配列を重点的に抽出し，これらの伸長リピート配列が単独，あるいは，複数の組み合わせで，発症者において，over-representation されている伸長リピート配列の発見をめざし，神経変性疾患発症に関連する病態機序の解明を目指す．

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、封入体形成が病理学的特徴である神経変性疾患に着目して、非翻訳領域の伸長リピート配列を探索し、神経変性疾患の発症機構を解明することを目的とする。この考え方は、非翻訳領域のリピート伸長配列は、Repeat Associated Non-AUG translation (RAN translation) を引き起こし、異常なアミノ酸配列を有するタンパクへの翻訳が行われ、その結果、封入体を形成するという仮説に基づいている。リピート伸長配列の検出は、short read sequencerでは困難であることから、long read sequencer による全ゲノムシーケンス解析を実施し、3-6塩基の繰り返し配列に焦点を当てて、伸長リピート配列を検出する独自に開発したプログラムを用いて、伸長リピート配列をゲノム全域から検出し、神経変性疾患の発症に関連する伸長リピート配列の発見を進めた。解析対象として、発症年齢の早いextreme phenotype を示すアルツハイマー病、家族歴を有する家族性アルツハイマー病症例を中心に7例を選択して、long read sequencer (Pacific Bioscience s 社のSequel II) を用いて、ロングリードシーケンス解析を実施した。long read sequencerは、error readを生じやすく精度が十分でないことから、circular consensus sequencing (CCS) というアルゴリズムにより、得られた全ゲノム配列データを用いた。その結果，これまでに報告のない、伸長リピート配列がさらに縦列に重複している例を見出した。本研究で開発したプログラムを用いて、伸長リピート配列の解析を進め、その疾患発症における意義の検討を進める。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では、伸長リピート配列がアルツハイマー病の発症に関与するという仮説に立ち、発症年齢の早いextreme phenotype を示すアルツハイマー病、家族歴を有する家族性アルツハイマー病症例を中心に7例を選択して、PacBio Sequel II を用いたロングリードシーケンス解析を実施した。long read sequencerは、error readを生じやすく精度が十分でないことから、circular consensus sequencing (CCS) というアルゴリズムにより、精度の改善が行われているが、伸長リピート配列のようなlow complexity sequenceに対しては、CCSアルゴリズムの有効性は限られていて、伸長リピート配列が、CCS readに取り込まれない可能性がある。この課題を克服するために、ロングリードシーケンス解析において、CCS read (HiFi read) だけでなく、CCSアルゴリズムを用いずにBAMファイルを生成することもあわせて行った。解析プログラムについては、3-6塩基の繰り返し配列に焦点を当てて、伸長リピート配列を検出するプログラムを独自に開発した。本プログラムは、検索する伸長リピートのモチーフ、リピート長の条件、さらに、伸長リピート配列中にリピート配列のinterruption を許容する条件などについて、柔軟なパラメータ設定を可能としたプログラムの開発が完了した。本プログラムを活用して、神経変性疾患の発症に関与する伸長リピート配列の網羅的な解析を進める。

Strategy for Future Research Activity

これまでの研究により、アルツハイマー病症例７例（早期発症例、家族性アルツハイマー病を含む）について、PacBio Sequel II を用いて、circular consensus sequencing (CCS) アルゴリズムによりHiFi read の取得、および、CCSアルゴリズムを用いないでBAMファイルの取得をあわせて完了した。伸長リピート配列の探索プログラムについては、3-6塩基の繰り返し配列に焦点を当てて、伸長リピート配列を検出するプログラムを独自に開発した。本プログラムは、検索する伸長リピートのモチーフ、探索するリピート長の条件、さらに、伸長リピート配列中にリピート配列のinterruption を許容する条件などについて、柔軟なパラメータ設定を可能としたプログラムの開発が完了した。本プログラムにより、ゲノム全域について、伸長リピート配列を強力に解析することが可能になり、これまでに報告のない、伸長リピート配列がさらに縦列に重複している例を見出している。本研究で開発したプログラムを用いて、伸長リピート配列の解析を進め、疾患発症における意義の検討を進める。これらの伸長リピート配列について、遺伝子の非翻訳領域に存在する伸長リピート配列を抽出し、中枢神経系における発現量の情報を含めてデータベース化し、アルツハイマー病症例群でどのような伸長リピートが存在するかについて、詳細な解析を進めていく。