| Project/Area Number |
23K24113
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| Project/Area Number (Other) |
22H02851 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 49030:Experimental pathology-related
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
五條 理志 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90316745)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
横田 貴史 大阪大学, 大学院医学系研究科, 招へい教授 (60403200)
小坂 仁 自治医科大学, 医学部, 教授 (90426320)
上 大介 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (80415588)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,290,000 (Direct Cost: ¥13,300,000、Indirect Cost: ¥3,990,000)
Fiscal Year 2024: ¥5,850,000 (Direct Cost: ¥4,500,000、Indirect Cost: ¥1,350,000)
Fiscal Year 2023: ¥5,460,000 (Direct Cost: ¥4,200,000、Indirect Cost: ¥1,260,000)
Fiscal Year 2022: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000)
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| Keywords | ミトコンドリア / 血液幹細胞 / 細胞移植 / ミトコンドリア病 / 遺伝子導入 / ミトコンドリアゲノム異常 / ミトコンドリア置換 / 骨髄移植 / ミトコンドリアゲノム置換 / mRNA transfection / Single cell ddPCR / Mitochondrial DNA / MirC / 血液幹細胞移植 |
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| Outline of Research at the Start |
ミトコンドリア病は現在も根治治療法がない希少難病である。特にミトコンドリアゲノムに変異を有するものは、治療の方法論すらな いのが現状であり、体細胞においてミトコンドリアゲノムに直接介入する方法はなかった。本研究の基盤は内在mtDNAを除去してニッチを作成 し、外来ミトコンドリアの取り込みをマクロピノサイトーシスによって亢進させ、mtDNAを外来のものと置換する技術である(Mitochondrial genome replaced Cell: MirC)。この技術を血液系に表現系を持つミトコンドリア病の根治療法開発のProof of Conceptを本研究にて獲得することを目標として いる。
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| Outline of Annual Research Achievements |
ミトコンドリアゲノムへの介入方法は、核ゲノムへの介入方法の飛躍的な発展とは対照的に、未だに確立されていない。我々は、線維芽細胞を対象にミトコンドリアゲノム削減の条件下に単離ミトコンドリアとの共培養するよことによって、ミトコンドリアゲノムが置換されることを発見した。このプロトコールを血液幹・前駆細胞に適応するために、技術開発を行い、ミトコンドリアゲノム置換が行われた細胞が生体に移植された後に、どのような振る舞いをするのかを観察することが、本研究の目的である。2年目の本年は、ミトコンドリアゲノム置換細胞の生体内での振る舞いを詳細に検討するために、血液幹細胞としてヒトCD34陽性細胞を用いて、ミトコンドリアゲノム置換を行うプロトコールを確立すべく検討を重ね、SOPのレベルにまで落とし込むことができた。このプロトコールを用いて、免疫不全マウスに移植を行い、Single cell RNA seqやFISHを用いてドナーミトコンドリアゲノムの生着状態を観察した。血液系だけではなく、実質臓器にも分布していることが明らかとなった。加えて、Intercellular mitochondrial transferの状況も確実となり、血液幹細胞移植によって幹細胞由来ミトコンドリアが生体内に分配されるシステムの存在が確認できた。この結果は、再現性を強固なものとするための実験を3年目にも行い、その結果を持って論文として報告する予定である。もう一つ、Mitochondrial -Nuclear Exchange (MNX) miceを利用して、血液幹細胞移植を行なった。この結果は論文として報告した。この方向性に関しては、in vitroにおいて、さまざまな細胞間でのMitochondrial transferの状況を確認しており、その詳細を3年目において更に検討をする予定としている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
血液幹細胞・前駆細胞におけるミトコンドリアゲノム置換細胞作出プロトコールの作成：プロトコール前半のミトコンドリアゲノム削減のための遺伝子導入方法はmRNAを用いたElectroporationによって、ミトコンドリア移行シグナルを持った制限酵素を導入する。細胞のViabilityおよびStemnessの保持が行える電圧、荷電時間などのOptimizationを行い、１つの条件を抽出することができた。また、ヒトCD34陽性細胞を用いて同様に、mRNA及びElectroporationの条件検討を行い、１つのプロトコールを確立した。
ミトコンドリア置換細胞の生体内での動態解析：マウス及びヒト血液幹前駆細胞において、ミトコンドリア置換細胞作出プロトコールが確定したことを受けて、生体ヘの移植実験を個体数を重ねて再現性を確保できる形でデザインした。モデルは、ヒト血液幹前駆細胞を対象にミトコンドリアゲノム置換を行い、免疫不全マウスへの移植とした。Single RNA seqを用いて、レシピエントの様々な臓器に対して、ヒトミトコンドリアゲノムとマウスミトコンドリアゲノムが共局在している状況が明らかとなった。これは、移植された細胞のミトコンドリアゲノムが、レシピエントマウスの臓器を構成する細胞に分配されたことを明示する結果であり、血液幹細胞移植によって全身へのミトコンドリアを分配するという治療スキームを強力にサポートしていると考える。加えて、血液幹細胞に供与されたミトコンドリアゲノムが安定して、幹細胞に存在し続け、分化細胞でも同様であるかの検討を行った。移植後早期には供与されたゲノムの存在は充分量確かめられたが、３週間後には生殖医療におけるミトコンドリア移植におけるReversionと同様にその存在量は低下していることが確認された。
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| Strategy for Future Research Activity |
2年目の研究においてc-kit+血液前駆細胞に対してミトコンドリア置換を実施する実証実験を行って きた。加えて、in vitroでの研究で、ミトコンドリアが細胞間を移動するには、極めて特徴的な性質を持っていること確かめられた。 本年度は、ドナーミトコンドリアはNZB マウス由来で、HPCsはB6より採取し、細胞移植は同系マウスへ行うシステムにて評価をする。このミトコンドリア置換細胞を用いた細胞移植後の外来ミトコンドリアの動態を、NZBとB6のミトコン ドリアゲノムのSNPを利用してIn situ hybridization及びsingle cell digital droplet PCRを用いて観察するとともに、動物の各臓器におけ るTranscriptome の変化をRNA sequenceを用いて観察する。MirCsを用いた細胞移植が、生着率やChimerismの程度にもたらす変化を観察すると ともに、その背景にあると考えられる細胞の代謝をSeaHorseを用いたミトコンドリア及び解糖系の賦活化状態との関連を検討する。また、外来 ミトコンドリアゲノムの生着の安定性に関して、経時的にその存在を確認するとともに、時間による変化が起こる場合には、そのメカニズムと して想定されるInnate immunityの状態をqPCRを用いて検索を行う予定とする。
もう一つのIn vivoでの研究として、細胞移植を受けるレシピエントをNdufs4 KOマウスとし、BackgroundであるWild typeのB6マウス由来ミト コンドリアをドナーミトコンドリアとして、Ndufs4 KOマウス由来HPCsからMirCsを作成し、細胞移植を用いる系で、ミトコンドリアゲノム置換 の医療応用の可能性を検討する。
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