Molecular pathogenesis of B-cell lymphoma in APOBEC3-deficient mice
| Project/Area Number |
23K24120
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| Project/Area Number (Other) |
22H02858 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 49030:Experimental pathology-related
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| Research Institution | Kindai University |
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Principal Investigator |
宮澤 正顯 近畿大学, 医学部, 教授 (60167757)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
博多 義之 近畿大学, 医学部, 講師 (30344500)
河原 佐智代 近畿大学, 医学部, 講師 (60297629)
月本 翔太 近畿大学, 大学病院, 助教 (40790762)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥10,530,000 (Direct Cost: ¥8,100,000、Indirect Cost: ¥2,430,000)
Fiscal Year 2024: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
Fiscal Year 2022: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
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| Keywords | APOBEC3 / リンパ腫 / Bリンパ球 / レトロウイルス / 腫瘍化 / 宿主因子 / 複製制限 / Bリンパ腫 / 胚中心 / CD40L / 抗原受容体 / 宿主遺伝子 / 発症因子 |
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| Outline of Research at the Start |
一本鎖DNAを標的とするシチジン脱アミノ化酵素APOBEC3は、レトロウイルス複製制限因子として生理的に機能する。我々は、APOBEC3が抗原刺激により活発に分裂する胚中心Bリンパ球に特異的に強発現することを発見した。一方、APOBEC3欠損マウスを長期間飼育していると、ほぼ全例でB細胞リンパ腫を発症した。これは、胚中心細胞で高発現するAPOBEC3がBリンパ球の腫瘍化を抑制していることを示唆する。その機序として、胚中心細胞で活性化に伴って内在性レトロウイルスが発現し、逆転写産物の染色体組込みが増加するが、APOBEC3はこれを抑制していると考えることができる。本研究ではこの仮説を検証する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
一本鎖DNAを標的とするシチジンデアミナーゼAPOBEC3は、レトロウイルス複製制限因子として機能する。我々は免疫組織学的解析により、APOBEC3が胚中心B細胞に特異的に強発現していることを発見した。一方、APOBEC3欠損マウスを長期間飼育していると、ほぼ全例でB細胞リンパ腫を発症した。これは、胚中心細胞で高発現するAPOBEC3がB細胞の腫瘍化を抑制していることを示す。その機序としては、胚中心細胞で内在性レトロウイルスが発現し、リンパ腫発症の原因となるが、APOBEC3は内在性レトロウイルスの発現と複製を抑制しているものと考えることが出来る。
この仮説を検証するため、先ずBリンパ球の増殖・分化とAPOBEC3発現との関係を切り分ける実験を行った。試験管内でCD40L刺激によりBリンパ球を胚中心細胞に分化させる系を用いると、抗原受容体からの刺激なしにAPOBEC3の発現が上昇した。一方、抗原受容体の架橋でBリンパ球は活性化したが、CD40Lによる刺激が無い条件下ではAPOBEC3の発現上昇はなかった。このことから、APOBEC3の発現は胚中心細胞の分化段階に特異的な現象であり、抗原受容体からの刺激とは無関係であると考えられた。
一方、厳密なSPF条件下で飼育したAPOBEC3欠損C57BL/6マウスの長期観察では、Bリンパ腫の発症頻度はこれまでの観察よりも低かった。内在性レトロウイルスの発現は腸内細菌の影響を受けることが知られており、飼育環境によりリンパ腫発症頻度が大きく変わる原因の一つと考えられた。そこで、より制御の容易な条件でレトロウイルス複製制御とBリンパ腫発症の関係を解析するため、APOBEC3欠損マウス及びこれとCD4陽性T細胞欠損マウスを交配したものにフレンドヘルパーウイルスを感染させ、長期間経過観察する実験を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
APOBEC3が胚中心細胞に高発現する理由は、この細胞が抗原受容体の刺激を受けて活発に分裂していることとは関係がなく、抗原受容体刺激なしでも、CD40Lを介する刺激でAPOBEC3の発現誘導が起こることを明らかにした。これは、APOBEC3の発現がBリンパ球の分化段階特異的な制御を受けていることを示す。
一方、APOBEC3欠損下でも厳密なSPF条件下で飼育したマウスではリンパ腫の自然発症頻度は高くないことが明らかとなった。微生物環境が内在性レトロウイルスの発現に影響を与え、内在性レトロウイルス抗原に対する自己抗体産生により腎・血管病変を発症する自己免疫病自然発症系統のマウスでも、無菌条件下ではそれらの発症頻度が低下することが知られている。このことから、環境微生物によってAPOBEC3の標的となる内在性レトロウイルスの発現が変動し、これによりリンパ腫発症頻度も変わるものと推測された。
一層制御の容易な条件下でBリンパ腫発症とAPOBEC3の関係を明らかにするには、通常Bリンパ腫発症を誘導することのないフレンド白血病ヘルパーウイルス（F-MuLV）の接種により、APOBEC3欠損下でBリンパ腫が発生するか否かを解析するのがより適切と考えられた。これまでの解析から、野生型のC57BL/6マウスにF-MuLVを接種しても何らの病変も生じないこと、CD4陽性T細胞欠損下では長い潜伏期の後単球・顆粒球系白血病が生じることがわかっている。APOBEC3の単独欠損またはこれとCD4陽性T細胞欠損の組み合わせで、高頻度にBリンパ腫が発生する可能性があり、研究計画が前進している。
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| Strategy for Future Research Activity |
1）Bリンパ球におけるAPOBEC3発現誘導に抗原受容体刺激とCD40刺激が果たす役割を切り分けて解析するため、試験管内でBリンパ球にCD40刺激を加える系に抗IgM抗体による抗原受容体刺激を併用し、APOBEC3発現の変動をFLAGタグの細胞内染色により検討する。なお、CD40刺激の無い条件で抗原受容体を架橋するとBンパ球に細胞死を誘導するので、時間経過を追い、細胞死が起こる以前の段階で、抗原受容体刺激のみ、CD40刺激のみ、両者併用の場合を比較する。
２）上記試験管内CD40刺激により、APOBEC3発現上昇と共にBリンパ球で内在性レトロウイルスの発現が誘導される可能性がある。Bリンパ球のCD40刺激による内在性レトロウイルス発現誘導の可能性を解析するため、刺激前後のBリンパ球RNAを用いたRNAseqによる網羅的解析と、細胞表面への内在性レトロウイルスenv遺伝子産物発現の蛍光セルソーター解析の両面から、これを検討する。その際、APOBEC3欠損マウスと野生型マウスでの内在性レトロウイルス発現誘導パターンを比較する。
３）これまで、脾限局巣形成ウイルス（SFFV）を含まないF-MuLVをCD4陽性T細胞機能欠損マウスに感染させた場合、単球・顆粒球系細胞由来の白血病を発症することを報告してきた。APOBEC3欠損条件下では、これに代わってBリンパ腫が発生する可能性がある。そこで、先ずAPOBEC3欠損マウスに既に入手済みの蛍光標識F-MuLVを感染させ、経時的に白血病発症の有無とその表現型を観察する。Bリンパ腫の発症を見た場合は、蛍光標識の有無によりF-MuLVの関与を検証する。また、CD4陽性T細胞とAPOBEC3の二重欠損マウスを交配により作成し、F-MuLV感染により単球・顆粒球系に代わってBリンパ球の腫瘍化が起こるかを観察する。
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Report
(1 results)
Research Products
(8 results)
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[Presentation] DOCK8-expressing T follicular helper cells newly generated beyond self-organized criticality cause systemic lupus erythematosus (SLE)2022
Author(s)
Shunichi Shiozawa, Ken Tsumiyama, Yumi Miyazaki, Kenichi Uto, Keiichi Sakurai, Takahiko Horiuchi, Tsukasa Matsubara, Takashi Yamane, Yohei Mukai, Takuji Enya, Masaaki Miyazawa, Kazuko Shiozawa
Organizer
第51回日本免疫学会学術集会
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