自然免疫反応とCOX2/PGE2経路による転移微小環境の構築
| Project/Area Number |
23K24160
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| Project/Area Number (Other) |
22H02899 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 50010:Tumor biology-related
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
大島 浩子 金沢大学, がん進展制御研究所, 准教授 (80362515)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥13,000,000 (Direct Cost: ¥10,000,000、Indirect Cost: ¥3,000,000)
Fiscal Year 2025: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
Fiscal Year 2024: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000)
Fiscal Year 2022: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000)
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| Keywords | 微小環境 / 転移 / 繊維化 / 消化管がん / マウスモデル / 大腸がん / 消化器がん |
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| Outline of Research at the Start |
これまでに、消化器がんで認められるドライバー遺伝子変異を導入したマウスモデルを作製し、発生した腫瘍からオルガノイドを樹立して、それらの脾臓移植による肝転移モデルを樹立した。これまでの予備的実験結果により、宿主側の自然免疫反応、および炎症シグナルが肝転移巣形成に何らかの役割を果たすと考えられた。本研究では、これまでに樹立したオルガノイド移植モデルを使って、TLR2/4を介した自然免疫反応と、COX2/PGE2経路を介した炎症反応に着目し、微小環境が、がん細胞の生存や増殖、運動性などを制御するメカニズムを個体レベルおよび分子レベルで明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は、これまでにヒト大腸がんで多く認められる、４種類のドライバー遺伝子、Apc、Kras、Tgfbr2、Trp53を導入したマウスモデルを交配により作製し、腸管に発生した腫瘍組織からオルガノイドを樹立した（以下、AKTP細胞）。また、ヒト胃がん腫瘍では、Wntリガンド(W)依存的な腫瘍が多く存在することから、胃粘膜細胞でWntリガンドを発現し、さらにKras、Tgfbr2、Trp53を導入したマウスモデルを交配により作製し、WKTP細胞を作製した。これらのAKTP及びWKTP細胞は、脾臓移植あるいは門脈注射により肝転移させる事が出来る。このモデルでは、免疫反応の正常なC57BL/6への移植が可能であり、ヒト転移巣と類似した、線維芽細胞の増殖による間質増生と、マクロファージやリンパ球浸潤による炎症性微小環境形成が認められる。本研究では、このモデルを用いて、転移形成における宿主反応の関与について、炎症性微小環境形成、自然免疫反応、繊維化形成に関連する遺伝子欠損マウスを用いた移植実験による検討を実施した。これまでにAKTP細胞の肝転移形成に、PGE2受容体のEP4、Toll様受容体のTLR2/4、さらにTGFbeta経路が関与している可能性が示唆された。しかし、TLRのco-factorである、Myd88が欠損した宿主マウスだと、転移巣形成が抑制されなかった。このことから、我々は、Myd88を介さないTLRシグナル、すなわちTRIFシグナルに着目した。そこで、TRIF欠損マウスを導入し、TRIF欠損によるTLR/TRIF経路の関与について検討した。しかし、宿主側のTRIFシグナルは関与していない可能性が示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに、炎症経路COX2/EP4経路、自然免疫に重要な経路である、Toll様受容体のTLR2/4の遺伝子、およびMyd88欠損マウス、さらに、線維化に重要と考えられるTGF経路を遮断するためにTgfbr2遺伝子欠損マウスに、ヒト大腸がんで認められるのと同じドライバー遺伝子変異を導入したAKTP細胞を脾臓移植した。この結果、自然免疫に重要な経路である、Toll様受容体のTLR2/4の遺伝子欠損マウスでは肝転移巣形成が抑制された。しかし、TLRのコファクターであるMyd88遺伝子欠損マウスでは、肝転移巣形成が抑制されなかった。この結果から、Myd88を介さないTLR2/4シグナル関与が考えられたため、TRL4/TRIFを介した経路が関与している可能性を考え、TRIF欠損マウスを導入し、AKTP細胞を移植して転移巣形成に関与しているかどうか、検討した。しかし、TRIF欠損による転移腫瘍抑制が認められなかったことから、Myd88やTRIFを介さない経路が腫瘍形成に関与している可能性が考えられた。また、TLR2とTLR4のどちらが転移腫瘍形成に関与しているか検討することを計画し、それぞれの単独の欠損マウスの作成を実施している。また、我々の着目している炎症シグナルがどのように腫瘍形成に関わっているかについて、in vitroの系での観察を目的とし、継代可能なように、p53遺伝子を欠損するような各遺伝子の欠損マウス(TLR2/4(fl/fl)/p53(fl/fl)/ROSA-Cre, EP4(fl/fl)/p53(fl/fl)/ROSA-Cre)を作成を目指し、マウスの掛け合わせを進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和６年度は、胃がん・腸管がんおよび胆管がんマウスモデル、およびマウス腫瘍由来オルガノイド、そしてがん随伴線維芽細胞(CAF)を用いた実験を実施する。以下の研究を実施する。
(1)昨年度から、Trp53遺伝子欠損マウスとEP4遺伝子欠損マウスを掛け合わせてTrp53R270H/R270H/EP4fl/fl/ROSA-CreERT2マウスを作成を進めている。今年度は、作成した複合マウスに、転移性マウス腸管がんオルガノイド（AKTP）あるいは胃がんオルガノイド（WKTP）を用いて、脾臓移植を行い、肝転移巣から間質線維芽細胞（imCAF）を樹立して、タモキシフェンの投与により、EP4遺伝子を欠損するCAFを樹立する。これらのCAFの細胞とAKTPおよびWKTP細胞との共培養実験を行い、EP4欠損によるCAF活性化やオルガノイドの増殖、運動、および形態変化についてタイムラプスイメージングシステムを用いて解析する。
(2)これまでの結果から、TLR2/4のダブルKOマウスで、転移巣抑制が認められるが、TLR2とTLR4、どちらが必要かということを検討するため、それぞれのKOマウスを作成し、これに脾臓移植することで、宿主側のどちらのTLRが重要かどうか検討する。
(3)肝臓の繊維化に重要な線維芽細胞増殖因子受容体（FGFR）１のアゴニストVHH抗体を用いて検討することを予定している。これまでの研究結果から、FGFシグナルを亢進させると肝臓の線維化を抑制することが報告されている。我々のこれまでの結果からも、線維化が肝臓転移巣の発生に重要なことを示している。そこで、樹立した転移性マウス腸管がんオルガノイド（AKTP）を脾臓移植し、その後マウスにFGFR1アゴニストVHH抗体を投与し、腫瘍発生について解析を行う。
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Report
(2 results)
Research Products
(10 results)
