ゲノム・エピゲノム編集をもちいたダウン症候群の知的障害に対する遺伝子治療法開発

• Project/Area Number: 23K24300
• Project/Area Number (Other): 22H03039 (2022-2023)
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund (2024); Single-year Grants (2022-2023)
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 52050:Embryonic medicine and pediatrics-related
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 北畠 康司 大阪大学, 大学院医学系研究科, 教授 (80506494)
• Project Period (FY): 2024-04-01 – 2027-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000); Fiscal Year 2026: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000); Fiscal Year 2025: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000); Fiscal Year 2024: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000); Fiscal Year 2023: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000); Fiscal Year 2022: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
• Keywords: ダウン症候群 / iPS細胞 / ゲノム編集 / 知的障害 / 遺伝子治療 / エピジェネティック編集

Outline of Research at the Start

ダウン症候群では知的障害が必発だが治療法はまだない。申請者は、ダウン症アストロサイトではNLRP3インフラマソームの活性化により炎症応答が増大し、神経細胞にアポトーシスが起こること、その責任遺伝子がDYRK1Aであることを見出した。そこで本研究課題では、ゲノム編集・エピジェネティック編集とアレル特異的SNPの組み合わせによるDYRK1Aの選択的発現制御を行い、神経細胞死の抑制を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

ダウン症候群は21番染色体のトリソミーによって引き起こされる。申請者らは疾患特異的iPS細胞とゲノム編集技術を組み合わせることで、ダウン症の中枢神経病態の解析を行うとともに治療法の開発を目指している。健常アストロサイトは本来、神経細胞への保護作用をもっており、両者を共培養すると神経細胞のアポトーシスが抑制されるが、ダウン症アストロサイトではこの保護作用が消失するばかりか、神経細胞に過剰なアポトーシスを誘導してしまう。さらにダウン症アストロサイトでは自然免疫の重要な鍵を握る“NLRP3インフラマソーム”の活性が著しく上昇していること、その責任遺伝子が21番染色体上のDYRK1A であることを見出した。このDYRK1Aは、ダウン症神経前駆細胞にも作用し、その増殖を抑制し、かつ神経系への分化誘導を阻害する。本研究課題ではこのDYRK1Aに対してゲノム編集・エピジェネティック編集をもちいることで治療法開発につなげることを目指している。これまでの研究により、新規ゲノム編集技術であるCRISPR-Cas3がiPS細胞およびアストロサイトにおいて効果的にゲノム切断を起こし、DYRK1Aの欠失と発現量低下をもたらすことをin vitroで確認することができた。そしてDYRK1Aの重要な酵素活性ドメインを含むエクソン4の近傍にアレル特異的SNPを探しだし、これにCRISPR-Cas3を作用させてみることで、DYRK1Aのエクソン4のゲノム量減少と発現量の低下を確認することができた。さらに切断活性を失くしたdead Cas9 (dCas9)にDNMT3A、3L、KRABをつないだCRISPRoffベクターを用いることにより、DYRK1Aの転写開始点近傍のDNAメチル化を変化させること、DYRK1Aの発現量を低下させることに成功した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

CRISPRoffベクターをもちいたエピジェネティック編集により、iPS細胞においてDYRK1Aの発現量を抑制することができた。iPS細胞における発現制御は神経系へと分化誘導を進めた後も効果が維持されており、ダウン症iPS細胞由来神経細胞ならびにアストロサイトの両細胞系においてDYRK1A発現が低下していることが分かった。エピジェネ編集を加えたアストロサイトでは炎症マーカーの発現が低下し、神経細胞との共培養においても神経細胞死を抑制することが判明した。

Strategy for Future Research Activity

これらゲノム編集・エピジェネ編集をマウスにおいて検証し、かつ実際の臨床応用につなげるためには、神経系へと送達可能なドラッグデリバリー技術の開発が必要となる。一般的にはアデノ随伴ウイルスベクター（AAV）が用いられるが、CRISPR-Cas3は分子が大きく、AAVには搭載が困難であるため、脂質ナノ粒子（lipid nanoparticle）の利用を目指している。すでに神経系へと送達高率の高いLNPの開発に成功しつつあることから、これらのin vivoでの検証を進めたい。