| Project/Area Number |
23K24306
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| Project/Area Number (Other) |
22H03045 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 52050:Embryonic medicine and pediatrics-related
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
山岸 敬幸 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 特任教授 (40255500)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
古道 一樹 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (10338105)
内田 敬子 東京医科大学, 医学部, 准教授 (50286522)
湯浅 慎介 岡山大学, 医歯薬学域, 教授 (90398628)
石崎 怜奈 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (70528299)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000)
Fiscal Year 2024: ¥5,200,000 (Direct Cost: ¥4,000,000、Indirect Cost: ¥1,200,000)
Fiscal Year 2023: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
Fiscal Year 2022: ¥6,630,000 (Direct Cost: ¥5,100,000、Indirect Cost: ¥1,530,000)
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| Keywords | 発生・分化 / 遺伝子 / 循環器・高血圧 / 発現制御 / シグナル伝達 / 多因子遺伝 / 総動脈幹症 / Tbx1 / Tbx20 / 葉酸 / 先天性心疾患 |
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| Outline of Research at the Start |
先天性心疾患の主要な成因である多因子遺伝による発症機構の解明と新規発症予防・治療法の開発を目指し、正常な心臓発生過程および先天性心疾患の発症機序に遺伝因子と環境因子がいかに寄与するか、臨床と基礎、ヒトと実験動物の両面からアプローチし、分子基盤を解明する。先天性心疾患のうち特に臨床上難治性の心臓流出路疾患と心室異常に着目し、遺伝因子として複数の疾患家系を対象とした全エキソーム遺伝子解析で検出された遺伝子バリアントおよび環境因子として葉酸を筆頭に化合物ライブラリーから絞った候補因子に対し、ヒトiPS細胞と当研究室独自の疾患モデルマウスで検証する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
神経堤細胞系譜が特異的にGFPを発現するマウスとTbx1発現低下マウスを交配し、妊娠母体に葉酸を腹腔内注射した葉酸群では、溶媒の重炭酸を注射したVehicle群に比して、胎仔の総動脈幹症の病型が軽症化した。葉酸群ではVehicle群に比して発生中の心臓流出路および咽頭弓動脈周囲に遊走した神経堤細胞数が有意に増加しており、左第6咽頭弓動脈の低形成が改善していた。またVehicle群で神経堤細胞が耳胞周囲から咽頭弓背側に異常な集塊を形成し、神経細胞に分化していることが確認された一方、葉酸群ではこの異常な細胞集塊が縮小していた。以上から、Tbx1発現低下マウスでは神経堤細胞が異所性に神経細胞に分化するが、葉酸投与によりその異所性分化が抑制されて心臓表現型が軽症化することが示唆された。さらに、E10.5胎仔の心臓・咽頭弓組織を摘出してsingle cell RNA-seqの結果、葉酸群ではNotchレセプターとその下流遺伝子の発現が増加していた。Notchレセプターの活性化を示すNotch1細胞内ドメイン(N1ICD)の免疫染色で、葉酸群では第6咽頭弓動脈周囲の神経堤細胞でN1ICDの発現が増加していた。また、葉酸群ではMidkine-Notch2経路のシグナル伝達が増加していた。葉酸投与によってMidkineの発現が増加し、神経堤細胞が発現しているNotch1/2にシグナル伝達を行うことにより、神経細胞への分化が抑制されることが推測された。加えて、胎仔中の化学物質を網羅的に測定するメタボローム解析により、葉酸群ではメチル化基質が低下している事が明らかになった。そのため、葉酸投与によりDNAのメチル化に影響し、関連遺伝子の発現が変化している事が推測された。また妊娠母体に葉酸を過剰に投与した野生型マウスでは、胎仔に両大血管右室起始、心室中隔欠損などの先天性心疾患が認められた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
上記、2023年度までの研究実績の概要に記載の通り、当初の研究計画のうち、①葉酸による先天性心疾患軽症化の解析、1) 葉酸による総動脈幹症の軽症化の再現、2)葉酸のTbx1neo/neoマウスに対する作用の検討、②心臓神経堤細胞の発生の可視化、1)P0-Cre::CAG-CAT-EGFPマウスの交配、2)P0-Cre::CAG-CAT-EGFPマウス解析法の改良、③葉酸の心臓神経堤細胞に対する作用機序の解明、1)葉酸投与Tbx1neo/neoマウス胚の分子的解析まで進み、2) iPS細胞から誘導した心臓神経堤細胞の分子的解析について、ヒトiPS細胞から神経堤様細胞（iNCLC）を誘導する分化系（Nature 2010）の確立およびマウス胎仔in vivoから神経堤細胞を摘出することに成功した。この細胞を用いてsingle cell RNA-seq解析で、葉酸添加による心臓神経堤細胞の制御に関与する分子およびエピジェネティック作用を解明した。また④葉酸過剰添加による先天性心疾患モデルマウスが得られた。しかし、single cell RNA-seq解析の結果の検証ならびにiPS細胞を用いた実験に時間がかかり、以下の研究計画について進めることができておらず、進捗としてはやや遅れている：⑤先天性心疾患モデルマウスにおける心臓神経堤細胞異常の分子機構の解明、⑥天然化合物ライブラリーを用いた心疾患の発症ないし重症化を予防する因子の同定。
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| Strategy for Future Research Activity |
Tbx1発現低下マウスでは、神経堤細胞は背側大動脈周囲まで遊走すると神経細胞に分化し集塊を形成するため、咽頭弓動脈周囲と流出路まで到達する細胞は少なく、流出路中隔が形成されない総動脈幹症を発症することが明らかになった。葉酸を投与することにより、Notchシグナルが亢進し、神経堤細胞が多能性を維持しやすくなり、神経細胞への分化も阻害され、神経堤細胞がより多く咽頭弓動脈周囲まで遊走し、結果として流出路に到達する細胞が増加し、流出路中隔が一部形成されて総動脈幹症の表現型が改善する。本研究で今後さらに葉酸による遺伝子発現変化のメカニズムを明らかにする必要がある。Midkine-Notch2経路の免疫染色によりsingle cell解析の結果を検証する。また、メタボローム解析によって推測されたDNAメチル化の変化を確認するため、特定のDNA領域のメチル化をパイロシークエンスによって明らかにする計画である。
さらに2024年度以降、以下の残りの研究計画について進める。
ヒト先天性心疾患を再現し心臓神経堤細胞の挙動を可視化するモデルマウスの作製および１）先天性心疾患モデルマウスにおける心臓神経堤細胞異常の分子機構の解明：妊娠母体への葉酸過剰投与胚に観察された先天性心疾患について、メタボロームおよびDNAメチル化解析により、先天性心疾患を起こす代謝経路の異常および分子機構を解明する。また、Tbx20の遺伝子改変マウスに観察された心室中隔欠損症に関与する分子機構についても解明する。
２）天然化合物ライブラリーを用いた心疾患の発症ないし重症化を予防する因子の同定：神経堤細胞を制御する可能性のある因子について、人体に安全な2840種の天然化合物を含むライブラリーによりスクリーニングする。
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