| Project/Area Number |
23K24317
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| Project/Area Number (Other) |
22H03056 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 53010:Gastroenterology-related
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| Research Institution | University of Fukui |
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Principal Investigator |
中本 安成 福井大学, 学術研究院医学系部門, 教授 (40293352)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
平松 活志 福井大学, 学術研究院医学系部門, 客員准教授 (30646849)
山下 太郎 金沢大学, 医学系, 教授 (90377432)
島上 哲朗 金沢大学, 保健管理センター, 助教 (50436820)
野阪 拓人 福井大学, 学術研究院医学系部門(附属病院部), 講師 (70748441)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,290,000 (Direct Cost: ¥13,300,000、Indirect Cost: ¥3,990,000)
Fiscal Year 2024: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000)
Fiscal Year 2023: ¥5,460,000 (Direct Cost: ¥4,200,000、Indirect Cost: ¥1,260,000)
Fiscal Year 2022: ¥6,760,000 (Direct Cost: ¥5,200,000、Indirect Cost: ¥1,560,000)
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| Keywords | 肝細胞がん / 転移 / ドライバー遺伝子 / 免疫チェックポイント阻害薬 / 循環腫瘍細胞 |
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| Outline of Research at the Start |
進行がんに対する最新の免疫チェックポイント阻害薬（ICI）治療は、既存の治療を上回る効果を発揮しているが、根治的な抗がん作用としては限定的である。そこで、進行肝細胞がんに対するICI治療中に肝内・肝外転移を生じた患者において、末梢血の循環腫瘍細胞（CTC）からがん転移を引き起こすドライバー遺伝子を同定し、新たな分子創薬シーズとして提案する。これより、本研究成果は進行肝がんに対する新規の分子標的治療の開発に繋がるものと期待される。
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| Outline of Annual Research Achievements |
進行肝細胞がんに対する最新の免疫チェックポイント阻害薬（ICI）治療は、既存の分子標的薬や化学療法を上回る治療効果を発揮しているが、根治的な抗がん作用や生命予後の改善効果は限定的である。本計画では、進行肝がんに対するICI治療経過において、患者末梢血の循環腫瘍細胞（CTC）をシングルセル解析（scRNA-Seq）し、治療耐性・転移を呈した患者に特有な責任候補遺伝子群を抽出した。
１）患者CTCの採取と細胞分子病態の解析： 肝癌に対するICI：Atezolizumab-Bevacizumab併用療法（Atezo-Bev）の治療前、3週後、効果判定時に末梢血CTCを採取した。がん進展に関連する373遺伝子の発現変化を次世代シーケンサー（NGS）で解析し、GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）でパスウェイ解析を行った。
２）治療耐性・転移の責任候補遺伝子群の抽出： 治療有効PR群のCTC数は治療経過で減少した（治療前/効果判定時：141 vs. 58，p=0.01）。NGS解析ではPR群のCTCはアポトーシス経路関連遺伝子（FAS，TP53）の発現が、PD群ではTGF-β経路関連遺伝子（CDKN2B, GRB2, PIK3R1）の発現が有意に上昇していた（p＜0.05）。
３）TGF-β経路関連遺伝子による早期治療反応性： 治療３週後の末梢血CTCにおいて、TGF-β経路関連遺伝子を詳細に検討したところ、PR/SD群で発現が低下しPD群で発現亢進していた（p＜0.05）。この結果は、TGF-β経路関連遺伝子がAtezo-Bev治療に対する早期反応性を反映するバイオマーカーである可能性を示唆した。
これより、肝がんICI治療中の循環腫瘍細胞における遺伝子発現が治療効果と相関しており、がん進展・治療耐性と関連するドライバー遺伝子となる可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究において、令和５年度は１）－３）が計画されていた。ほぼ予定通りに進捗しており、３年計画の３年目：令和６年度に向けて、４）ゲノム編集技術を用いた遺伝子ノックアウト、がすでに開始されている。おおむね順調に進展しているものと考えられ、４）として継続中の計画は以下のごとくである。
４）ゲノム編集技術を用いた遺伝子ノックアウト ⇒３）で選択された候補遺伝子群について、以下の手順でCRISPR-Cas9システムによりノックアウトする。
a. ライブラリーの作成：治療標的遺伝子に対する一本鎖ガイドRNA（sgRNA）を、プラスミドベクターpCRISPR-LvSG03に組込む。 b. レンチウイルス粒子の精製、濃縮：［a.のsgRNA配列を組込んだpCRISPR-LvSG03／パッケージングpCMV-dR8-2DVP／エンベロープpCMV-VSV-G］をHEK293FT細胞に導入し、48時間後の培養上清を濃縮する。 c. sgRNAによる遺伝子ノックアウト：b.のウイルス粒子をCas9エンドヌクレアーゼを恒常的に発現する肝がん細胞株（PLC/PRF/5, C3A, SK-HEP-1他）に感染導入して、puromycinにより非導入細胞を除去し、sgRNA導入細胞集団を樹立する。
※ 樹立された細胞集団における治療標的遺伝子のノックアウトは、次の４)にて検証する。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の計画通り、１）－３）に加えて４）が進展しており、今後は以下の５）の研究を予定している。
５）転移能の in vivo スクリーニングによるドライバー遺伝子の選択 ⇒４）のsgRNAによって候補遺伝子がノックアウトされた肝がん細胞集団について、in vivo マウスモデルでの転移能を評価しドライバー候補遺伝子を選択する。
a. がん細胞株のsgRNA導入率：４）がん細胞集団のsgRNA頻度をNGS解析する。 b. in vivo 転移モデル：４）がん細胞集団をNSGマウスにおいて、門脈注入(肝転移)；尾静脈注入(肺転移)して、２－４週間後の転移巣(個数、サイズ)を定量する。NSGマウスは、T／B／NK細胞の欠損により、移植細胞の生着率が高い。 c. 転移巣のsgRNA導入率：b.転移組織からゲノムDNAを抽出して、sgRNA頻度をNGS解析する（MAGeCKワークフロー）。 ※ a.- c.導入率が低下したsgRNAを検出することによって（ネガティブ選択）、そのsgRNAが標的とする宿主遺伝子が、がん転移のドライバー候補遺伝子として抽出される。
６）がん転移のドライバー遺伝子の非臨床試験 ⇒４）ドライバー候補遺伝子に関して、in vitro / in vivo 実験系おける機能的解析を行う。 a. in vitro 評価系： a-1) EMT誘導能、a-2) 薬剤耐性、アポトーシス、a-3) 細胞増殖、a-4) 浸潤活性、a-5) 細胞周期、について検討する。 b. in vivo 評価系（非臨床試験）： 免疫能の正常な肝がん転移モデル（immunocompetent, inbredマウス）を用いて、がん転移の制御能を評価する。 ※ １）－５）で選択されたがん転移のドライバー候補遺伝子について、６）での転移能が検証されたものは新たな創薬シーズとして提案する。
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