| Project/Area Number |
23K24321
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| Project/Area Number (Other) |
22H03060 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 53010:Gastroenterology-related
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
高山 哲治 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 教授 (10284994)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡本 耕一 徳島大学, 病院, 講師 (60531374)
岡田 泰行 徳島大学, 病院, 助教 (60815447)
佐藤 康史 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 特任教授 (80343383)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,550,000 (Direct Cost: ¥13,500,000、Indirect Cost: ¥4,050,000)
Fiscal Year 2024: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2023: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000)
Fiscal Year 2022: ¥7,670,000 (Direct Cost: ¥5,900,000、Indirect Cost: ¥1,770,000)
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| Keywords | 大腸癌 / オルガノイド / 染色体不安定性 / 全ゲノム解析 / 蛍光イメージング / patient-derived organoid / 蛍光タイムラップス観察 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、切除不能大腸癌患者を対象に治療前及び化学療法に耐性獲得後の癌組織より患者由来オルガノイド を樹立する。次いで、これらのオルガノイドの全ゲノム解析を行い、染色体不安定性に関わる候補遺伝子を調べる。さらに、染色体不安定性の高いオルガノイドにおける候補遺伝子をノックダウンし、蛍光ライブイメージング法により染色体不安定性遺伝子を調べる。また、同一症例における治療前と耐性獲得後オルガノイドの全ゲノムデータをサブトラクションし、耐性候補遺伝子を絞り込み、遺伝子導入実験により耐性遺伝子を同定する。本研究により、大腸癌における染色体不安定性の機序と薬剤耐性遺伝子を明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
大腸癌患者よりpatient-derived organoid(PDO)を樹立し、以下の解析を行なった。
1) 大腸癌患者からの治療前及び耐性獲得後のPDOの樹立：未治療の進行大腸癌(Stage IV) 58例よりPDOを樹立した。また、１次治療を行い効果判定でPD(進行)が認められた時点で再度内視鏡検査を行い耐性獲得PDOを４例樹立した。
2) PDOにおける染色体分析とCIN-scoreの評価：治療前PDO25例と耐性PDO4例を用いて染色体Gバンド分析を行なった。また、全ゲノム解析データを基に染色体不安定性の定量的評価法を行い、Chromosomal Instability (CIN)-scoreを算出した。治療前PDO25例中CIN-high 10例、CIN-mediate 6, CIN-low 9例であった。耐性獲得後のPDO4例ではCIN-low 2例、CIN-mediate 2例であった。
3) 治療前及び耐性PDOの染色体不安定性候補遺伝子の抽出：治療前のPDO25例の全ゲノム解析データを用いて、CIN-score highの治療前PDOのゲノム解析データからアミノ酸変異を伴う変異遺伝子を抽出し、CIN-score-lowのPDOの変異遺伝子を差引いて候補遺伝子を56個を絞り込んだ。このうち、文献検索などを行いCIN候補遺伝子を10個に絞り込んだ。
4) PDOにおけるα-tubulin/cadherin1の蛍光標識：CIN-score lowの治療前PDOを対象に、染色体分の微小管を構成するα-tubulinをGFP-Puroで、細胞膜のcadherin1をRFP-Puroでtaggingした。高速レーザー共焦点顕微鏡 を用いて、細胞分裂を多色タイムラプス観察できることを確認した。念の為、別のより強い蛍光色素を用いてHistoneH2bを標識したPDOも作製した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、概ね当初予定していた大腸癌症例数のpatient-derived organoid (PDO)を樹立することができた。同様に、治療により耐性を獲得した癌のPDOも樹立すことができた。
また、２５例のPDOを用いて全ゲノム解析を行い、CIN-score high 10例、CIN-score low 9例を見出し、これらのデータから、CINに関わる候補遺伝子を抽出することができた。
さらに、PDOの核内蛋白質(α-tubulinやhistoneH2b)を標識して、染色体不安定性を定量的に評価できる系を作製した。
これらを用いて、候補遺伝子をPDOに導入して、実際に染色体不安定性が生じるのか否か、薬剤耐性を獲得するのか否か、等々を検証することができる。
以上のことから、概ね順調に進展している評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、当初の予定通り、染色体不安定性候補遺伝子を蛍光標識PDOに導入し、染色体不安定性の変化を定量的に評価して染色体不安定性に関わる遺伝子を同定する。また、これらの遺伝子により薬剤耐性、浸潤能、stemness などの悪性度が変化するかどうかも評価する。これらの原因遺伝子や機序を明らかにすることで、染色体不安定性を標的とした大腸発癌機序の解明と、これらの遺伝子やシグナル伝達経路を標的とした新しい治療法の開発に繋がると考えている。
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