臓器境界部形成と境界部前癌病変形成に関わる胚葉間シグナルの解明

• Project/Area Number: 23K24393
• Project/Area Number (Other): 22H03134 (2022-2023)
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund (2024); Single-year Grants (2022-2023)
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 55010:General surgery and pediatric surgery-related
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 川口 義弥 京都大学, iPS細胞研究所, 教授 (60359792)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 古山 賢一郎 京都大学, iPS細胞研究所, 特定拠点講師 (10868798)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000); Fiscal Year 2024: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000); Fiscal Year 2023: ¥5,720,000 (Direct Cost: ¥4,400,000、Indirect Cost: ¥1,320,000); Fiscal Year 2022: ¥6,110,000 (Direct Cost: ¥4,700,000、Indirect Cost: ¥1,410,000)
• Keywords: 食道胃接合部 / 十二指腸乳頭部 / 胚葉間シグナル

Outline of Research at the Start

本研究では、複数の蛍光蛋白レポーターをもつヒトiPS細胞由来内胚葉・中胚葉細胞の共培養システムを用いて、“臓器境界”である食道胃接合部および十二指腸Vater乳頭部の形成過程が観察可能なオルガノイド作成技術を樹立する。さらに、作成した食道胃接合部オルガノイドを用いて前癌病変としての“Barret上皮モデル”を作成する。これらin vitroモデルを活用し、臓器境界形成過程と境界部に発生する癌ニッチ形成初期における胚葉間シグナルに着目し、発生現象とがん病態に共通する細胞挙動制御機構の理解を通じて新たな治療法開発の端緒を得ることを目指す。

Outline of Annual Research Achievements

人体には、食道－胃接合部や十二指腸Vater乳頭部、直腸歯状線、子宮頸部などの“臓器境界”が存在し、炎症や腫瘍の発生母地になり得るという臨床上の共通点があるが、臓器境界の形成機構や境界部での腫瘍発生メカニズムはよく分かっていない。
胎生期の細胞挙動は細胞の存在する環境によって制御される。また、癌細胞が自ら周囲環境を改変して癌ニッチを形成することから、内胚葉・中胚葉間シグナルの重要性が発生と癌の両方で示唆されている。
本研究では、“臓器境界”として食道胃接合部および十二指腸Vater乳頭部を取り上げ、iPS細胞由来内胚葉・中胚葉細胞の共培養系によってその発生過程を培養皿上で再現する。さらに前癌病変モデルとして“Barret上皮モデル”を樹立する。これらを用いて、正常臓器の境界形成に必須の胚葉間シグナルおよび癌ニッチ形成初期の胚葉間シグナルを同定し、新たな癌研究のプラットホームの樹立を目指す。
2022年度は、Cdx2-EGFP;Pdx1-tdTomatoノックイン株を樹立し、レポーターなしのヒトiPS細胞親株から作成したFOXF1陽性中胚葉細胞との共培養実験で十二指腸Vater乳頭部形成過程を直視化に観察することが可能なオルガノイド作成方法を確立した。別個に作成した内胚葉・中胚葉細胞それぞれの作成プロトコールおよび共培養タイムングの最適化はtry & errorの実験であり、最適条件の設定に相当苦労した。経時的に採取したサンプルに対して単細胞RNA-seqでの解析を加え、細胞クラスタリング解析により、原腸から膵および十二指腸への分化過程にある内胚葉細胞群と、それぞれの内胚葉を裏打ちする中胚葉細胞群を分別して把握することが可能となった。膵・十二指腸への運命決定に働く胚葉間シグナルの組み合わせ候補をligand-receptor解析から抽出した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

臓器形成期の十二指腸乳頭部形成に関わる胚葉間シグナルの同定に向けて、計画以上の進展があった。一方で、食道胃接合部の形成に関わるレポーターiPS細胞の作成に手間取っている。以上より総合して、概ね順調に進展していると自己評価する。

Strategy for Future Research Activity

研究が先行している十二指腸乳頭部形成に関わる胚葉間シグナル候補について、内胚葉および中胚葉細胞の単独培養に対するligand添加実験ないしは阻害実験を行い、細胞分化と組織構築形成に働く胚葉間シグナルを同定する。進行が遅れている食道胃接合部オルガノイドについても、Sox2-EGFP;GATA4-tdTomatoノックイン株を樹立し、共培養実験を行う方針である。前述の通り、共培養に使用する細胞の分化状態と共培養タイミングの最適化には相当の試行錯誤が必要な見込みであるが、同様の進め方で責任シグナルの同定を目指す。