Development of technology for in vivo intestinal engineering by transplantation of organoids after epithelial removal by using newly-synthesized chelating agents.

Research Project

Project/Area Number	23K24397
Project/Area Number (Other)	22H03138 (2022-2023)
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Allocation Type	Multi-year Fund (2024) Single-year Grants (2022-2023)
Section	一般
Review Section	Basic Section 55010:General surgery and pediatric surgery-related
Research Institution	Juntendo University
Principal Investigator	中村哲也順天堂大学, 大学院医学研究科, 特任教授 (70265809)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	土屋輝一郎筑波大学, 医学医療系, 教授 (40376786) 松本有加順天堂大学, 医学部, 助教 (50813672) 須田一人順天堂大学, 医学部, 准教授 (60784725)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2026-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2024)
Budget Amount *help	¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000) Fiscal Year 2025: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000) Fiscal Year 2024: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000) Fiscal Year 2023: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000) Fiscal Year 2022: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
Keywords	腸再生医療 / 組織エンジニアリング / 小腸移植 / 短腸症候群 / 腸管不全 / オルガノイド移植 / 再生医療 / 腸上皮置換
Outline of Research at the Start	大腸上皮を小腸上皮で置換し小腸機能再生を図る試みが注目されている。本研究は、健常な大腸粘膜を人為的に剥離する際の安全性確保のために新規に開発した化合物、すなわち分子サイズが大きく体循環への流入が少なく、しかも生体適合性をもち、十分な腸上皮剥離能をもつ高分子キレート化合物の腸組織への作用を解析する。また、これによる腸上皮剥離技術を応用し、安全で効率的な小腸上皮移植で大腸上皮を置換する技術確立を目指す。本研究で得られる成果は、安全な小腸機能再生のための臨床技術創出につながることが期待される。
Outline of Annual Research Achievements	初年度となる令和4年度には、主として以下の成果を得た。 1)サイズの異なる複数のPEG-EDTA合成と分析本研究のためにPEG-EDTAを考案し、すでに試作に成功した。ポリマーであるPEGは重合長を調節することで異なる分子サイズのものを得ることができる。本研究ではPEG部分の平均分子量約800、約2000、約4000など複数を準備し、異なるサイズのPEGにEDTAを結合させた新規化合物を合成した。異なるpHや温度条件における安定性をNMR解析などで検証をおこなった結果、これらPEG-EDTAが種々の条件下においても安定な化合物であることが明らかとなった。また、新規PEG-EDTAとCaイオンとの混合物のLC/TOF-MS分析の結果、PEG-EDTAがCaとの結合能を保持することも明らかになった。 2)PEG-EDTAによる腸上皮剥離能の解析 PEG-EDTAの大腸上皮剥離能をEDTAと対比し評価した。細片化したマウス腸組織を種々の濃度のキレート化合物溶液（PEG-EDTAまたはEDTA）に入れ攪拌震盪し、分離遊出する腸陰窩数を定量評価した結果（in vitroアッセイ）、分子サイズが増大するとやや遊離陰窩数の低下を認めるものの、PEG-EDTAが大腸上皮剥離能をもつことがわかった。開腹マウス大腸内腔にキレート化合物溶液（PEG-EDTAまたはEDTA）を注入する上皮剥離試験（in vivoアッセイ）でも、大腸の組織学的解析においてPEG-EDTAが上皮剥離効果を持つことが明らかにできた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 新規のキレート材、PEG-EDTAの合成に成功し、化合物の安定性、キレート能の評価を行うなど、計画に沿った研究を進めることができた。また、実際に本化合物により、マウスの大腸上皮剥離が可能であることが確認でき、本研究で目指す大腸上皮置換技術に応用可能であることの基礎が築けた。さらに、生きたままのマウスの開腹手術手技によって大腸上皮剥離ができることも提示することができ、次年度の研究計画にスムーズに移行する準備が整った。
Strategy for Future Research Activity	2年度目となる令和5年度以降には、以下の研究を進める予定である。 1)キレート化合物が腸粘膜組織に及ぼす作用の組織学的解析：マウス大腸にPEG-EDTAを作用させた際の腸粘膜変化を明らかにする。中でも特に、このあとの移植細胞生着に寄与すると推定される基底膜成分の残存度や障害の程度に着目し、ラミニン、各種コラーゲン分子発現量や配列構造に及ぼす作用を明らかにする。in vitroアッセイでは、マウス大腸より上皮オルガノイドを作成し、これにPEG-EDTAを異なる濃度で添加する。自己組織化で形成されるオルガノイドが、細胞接着性の変化により形態変容を呈する過程を解析するほか、細胞増殖や分化の変化、細胞死につき解析する。 2)PEG-EDTAの吸収動態と安全性解析：PEG-EDTAのマウスに対する毒性を、致死率を含めた個体変化および血清Ca濃度をアウトプットとして単回経口および腹腔投与で評価する。さらに、深麻酔したラットを用いて数時間にわたる腸管内腔灌流実験の条件を設定し、腸内腔側に灌流投与するPEG-EDTAの毒性を経時的血清Ca濃度、血中PEG-EDTA定量により解析する。 3)高分子キレート化合物で上皮を剥離した腸へのオルガノイド移植技術の確立：PEG-EDTAで安全に、かつ一定サイズのマウスおよびラット大腸上皮を剥離する技術を確立する。PEG-EDTA溶液の注入濃度、温度、pHに加え、大腸内腔暴露時間を最適化する。単に上皮層の剥離脱落だけでなく、残存組織の障害が最小化され、これに続くオルガノイド接着を許容する条件を最適化する。すなわち、剥離後の腸管組織について、基底膜構成分子の残存分布、腸管神経叢、線維芽細胞、免疫細胞、血管構造などの保存状態、および腸管構造障害のグレードを組織学的に解析する。