| Project/Area Number |
23K24452
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| Project/Area Number (Other) |
22H03193 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 56020:Orthopedics-related
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
大鳥 精司 千葉大学, 大学院医学研究院, 教授 (40361430)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高山 直也 千葉大学, 大学院医学研究院, 准教授 (10584229)
川上 英良 千葉大学, 大学院医学研究院, 教授 (30725338)
向井 務晃 千葉大学, 大学院医学研究院, 特任助教 (40907698)
江藤 浩之 千葉大学, 大学院医学研究院, 教授 (50286986)
志賀 康浩 千葉大学, 大学院医学研究院, 特任准教授 (90568669)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥16,900,000 (Direct Cost: ¥13,000,000、Indirect Cost: ¥3,900,000)
Fiscal Year 2026: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
Fiscal Year 2025: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
Fiscal Year 2024: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Fiscal Year 2022: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
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| Keywords | 血小板 / 多血小板血漿 / PRP / 骨 / iPS細胞 / 巨核球 / 骨癒合 / 骨再生 / iPS細胞由来血小板 / サイトカイン / 骨形成促進 / AI |
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| Outline of Research at the Start |
高齢社会において、骨折や運動器変性疾患が増加し、手術後の迅速な骨癒合が必須である。患者の自己血液を遠心して得られる、多血小板血漿(PRP)は骨癒合を促進するという報告が多数あるが、製剤の不均一性により、効果が不安定である。本研究では、均一な製剤開発のため、凍結乾燥ヒトiPS細胞由来巨核球・血小板製剤の骨癒合に最適な規格を細胞実験・動物実験にて明らかにする。またiPS細胞由来巨核球に骨癒合に有効な遺伝子操作導入を行い、より骨癒合に最適化した製剤の開発を行う。最終目標は、均一かつ骨癒合促進に最適化した血小板製剤の臨床応用である。
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| Outline of Annual Research Achievements |
不死化巨核球株の分化誘導により得られたiPS細胞由来巨核球および血小板 (iPS-derived megakaryocyte and platelets and: iMP)製剤の臨床応用を最終目標に研究を進めている。2023年度は以下4つの知見を得た。
(1)小型動物での臨床スケールで作製したiMP製剤の骨形成促進効果と長期安全性の検証：2022年度までにラット腰椎癒合モデルにて、骨形成促進効果と短期の安全性を確認した。2023年度は臨床応用を見据え、2022年度まで実験用の攪拌培養器でiPS細胞由来の巨核球株を分化誘導し、製剤を作製してきたが、100倍スケールで分化誘導可能なバイオクリアクター（VerMES; 京都大学江藤研開発）で作製したiMP製剤を使用した。結果、2022年度までと同等の骨形成促進効果を確認した。また6ヶ月間、明らかな有害事象を認めなかった。
(2)中型動物でのiMP製剤の短期・長期安全性の検証：非臨床POC獲得目的に、中動物（ラビット）のモデルでも(1)と同様骨形成促進効果と長期安全性の確認を行った。結果、中型動物でも骨形成促進効果と6ヶ月間、明らかな有害事象を認めなかった。
(3) 遺伝子強制発現巨核球由来の骨再生用機能強化型iMP製剤の開発：2022年度までにiMP製剤には含まれていないBMP-2の発現をELISAにて確認できた。しかし、発現量が乏しかったため、遺伝子をタンデムに繋いでBMP-2遺伝子を導入した、第2世代の機能強化型iMP製剤を作製した。ラット腰椎癒合モデルを用いて、骨形成促進効果を従来のiMP製剤と比較したが、若干の優位性は認めたが、明らかな有意差は得られなかった。
(4) iMP製剤の骨形成促進機序の検証：bMSCにiMP製剤を投与し、非投与のbMSCとRNA sequenceで遺伝子発現を比較し、複数のシグナル経路の変化を確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
臨床スケールで血小板を作製可能な攪拌培養器で血小板を作製し、その血小板製剤で、小型・中型動物でiMP製剤の効果と長期安全性を確認出来た。iMP製剤の作用機序の探索についても、RNA sequenceを行い、進行している。機能強化型iMP製剤の開発についても、BMP－2タンパクの発現量が、もう少し増えれば、有意に骨癒合を促進可能なレベルまで到達できている。
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| Strategy for Future Research Activity |
2024年は以下3点の検証を進める。
(1)iMP製剤の規格最適化：昨年度までに小型・中型動物での効果と長期安全性を確認した。今年度は、製剤の治験、上市に向け、最終的な製造工程や規格を確定する。
①巨核球の分化培養期間：現在5日間で行い、製剤の巨核球：血小板比は1:3である。7日間の培養により多くの血小板を得られるが、骨形成促進効果を喪失しないか確認を行う。②担体：現在は人工骨だが、徐放ゲルや人工骨＋徐放ゲルの検証を行う。③製剤作製過程や保存法：遠心条件、溶媒、各製造過程での保存温度などについて、より低コストで安全性が高い製造工程を検証する。
(2)遺伝子強制発現による機能強化型iMP製剤（改良株）：遺伝子導入のプロモーター領域を改変したベクターは昨年度作製済みであり、今年度は再度ラット腰椎癒合モデルで骨形成促進効果と安全性を検証する。また他遺伝子（例えばBMP-7）の同時強制発現による相加効果を図り、骨形成促進効果の向上を検証する。(1)と同時進行で進め、最終的な骨癒合に最適化したiMP製剤の規格を確定する。
(3) iMP製剤の骨形成促進機序の検証：RNA sequenceで得た知見を基に、up regulationした経路をinhibitorや遺伝子導入による阻害実験を行い、検証を進めていく。また2022年度までの実験結果より、iMP製剤はbMSCの分化促進よりも、増殖促進効果を介して、骨形成促進に寄与していると考えられ、iMP製剤含有の増殖促進因子の特定を進める。
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