| Project/Area Number |
23K24522
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| Project/Area Number (Other) |
22H03264 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 57020:Oral pathobiological science-related
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| Research Institution | Showa University |
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Principal Investigator |
美島 健二 昭和大学, 歯学部, 教授 (50275343)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田中 準一 昭和大学, 歯学部, 准教授 (40710166)
安原 理佳 昭和大学, 歯学部, 准教授 (20453649)
行森 茜 昭和大学, 歯学部, 助教 (60813748)
石田 尚子 昭和大学, 歯学部, 助教 (00882531)
渡辺 貴志 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, 技師 (50406815)
大庭 伸介 大阪大学, 大学院歯学研究科, 教授 (20466733)
阪井 丘芳 大阪大学, 大学院歯学研究科, 教授 (90379082)
馬渕 洋 藤田医科大学, 医学部, 准教授 (50424172)
鯨岡 聡子 昭和大学, 歯学部, 助教 (90824673)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000)
Fiscal Year 2024: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
Fiscal Year 2023: ¥5,850,000 (Direct Cost: ¥4,500,000、Indirect Cost: ¥1,350,000)
Fiscal Year 2022: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000)
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| Keywords | 唾液腺 / エピジェネチック制御 / 幹細胞 / 多分化能 / エピジェネティック制御 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、遺伝子発現を制御し細胞の多様性を決定するメカニズムとして知られるエピジェネティック制御機構に着目し、唾液腺幹細胞の多分化能維持におけるその役割を解明する。本目的のため、単一細胞レベルでの網羅的遺伝子解析とエピゲノム変化による転写活性を組合せることにより、より多種の細胞について詳細な唾液腺細胞系譜解析を行う。得られた結果をもとに、唾液腺幹細胞の多分化能の制御因子を同定し、遺伝子改変唾液腺オルガノイドを用いてその機能を解析する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
当該研究で利用する解析システムはChromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC（10xGENOMICS）システムである。本システムの特徴は、細胞から単離した核からDNA およびRNAを抽出し、DNA はscATACseq にRNA はscRNAseq解析にそれぞれ利用される。一方、10xGENOMICSはこれまでMultiome解析に必要な基盤技術を報告しているが、唾液腺組織に関する核単離方法に関する詳細な報告はなされていない。そこで、当該年度では、Chromium Nuclei Isolation Kit（10xGENOMICS）のプロトコールを基本に、胎生期唾液線から解析に必要なQualityの核単離条件を検討した。まず、本システムで最低必要となる細胞数1,000,000細胞を採取するために必要な胎生期マウスの必要数を検討した。すなわち、胎生13.5日の胎仔マウスから両側の顎下腺を摘出し、摘出した唾液腺をヒアルロニダーゼとコラゲナーゼで処理後、Trypleにて細胞を分散化し細胞数を計測した。その結果、唾液腺あたり約100,000細胞の採取が可能なことが明らかとなった。当該研究で必要とされる胎生16日および生後8週齢マウスの唾液腺から採取できる細胞数も同様にカウントし、胎生13.5日唾液腺は、妊娠マウス2腹、胎生16日唾液腺は1腹、および生後8週齢のマウスは1匹となることが明らかとなった。次に、これらのマウスより唾液腺をそれぞれ採取し、液体窒素で凍結し180℃の冷蔵庫で保存した。さらに、Chromium Nuclei Isolation Kitを用いて核を単離し、細胞数のカウントと位相差顕微鏡を用いて単離核のQuality を評価する事により核抽出の条件を検討し、その再現性について確認している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC（10xGENOMICS）システムを用いた唾液腺の解析は、初めての試みで有り、至適条件の検討に時間を要しているため。
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| Strategy for Future Research Activity |
Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC+Gene Expression Reagents（10xGENOMICS）システムを用いて胎生13.5日齢、胎生16日齢および生後8週齢のマウス顎下腺のエピゲノム（scATACseq）および遺伝子発現（scRNAseq）をシングルセルレベルで解析する。加えて、scATACseqおよびscRNAseq解析結果から擬似時系列解析により、各クラスタ間の時間的順序を予測し、細胞分化の方向性を決定する。この際、胎生13.5日, 胎生16日および生後8週のUMAP plotを重ね合わせ、細胞系譜の3系統、2系統ないし1系統のみに分化能を示す細胞クラスター間の発現遺伝子を比較し、多分化能の維持に関与する候補となる転写因子を同定する。さらに、同定された転写因子の機能を唾液腺オルガノイドを用いて解析する
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