| Project/Area Number |
23K24529
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| Project/Area Number (Other) |
22H03271 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 57030:Conservative dentistry-related
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| Research Institution | Hokkaido University (2023-2024)
Kyushu University (2022) |
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Principal Investigator |
友清 淳 北海道大学, 歯学研究院, 教授 (20507777)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
前田 英史 九州大学, 歯学研究院, 教授 (10284514)
糸山 知宏 九州大学, 歯学研究院, 助教 (50884433)
和田 尚久 九州大学, 歯学研究院, 教授 (60380466)
小幡 純子 九州大学, 歯学研究院, 助教 (70759448)
杉井 英樹 九州大学, 歯学研究院, 助教 (80802280)
藤野 翔香 九州大学, 歯学研究院, 助教 (60883832)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,290,000 (Direct Cost: ¥13,300,000、Indirect Cost: ¥3,990,000)
Fiscal Year 2025: ¥5,200,000 (Direct Cost: ¥4,000,000、Indirect Cost: ¥1,200,000)
Fiscal Year 2024: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2022: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
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| Keywords | 歯周組織再生 / 神経堤細胞 / ヒアルロン酸含有ナノファイバーメッシュ / 低分子化合物 / バイオミメティクス / 歯根膜幹細胞 / ナノファイバーメッシュ / iPS細胞 / ヒアルロン酸 |
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| Outline of Research at the Start |
歯周組織は神経堤細胞 (NC) に発生を由来することから、NCは歯周組織の発生過程を模倣する上で極めて重要な細胞であると考えられる。申請者らは人工多能性幹細胞 (iPSC) からNC様細胞 (iPSC-NC) への分化誘導法、およびiPSC-NCから歯根膜幹細胞様細胞 (iPSC-PDLSC) への分化誘導法を確立している。そこで本研究では、これらの細胞に対するゲノム解析結果から同定した、iPSC-NCからiPSC-PDLSCへの分化を誘導する形態形成因子および足場材について至適化を行い、その結果を基にiPSC-NC/形態形成因子/足場材から構成されるハイブリッド構造体を作製する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者らは、すでに生体吸収性低分子量ヒアルロン酸(LMWHA)含有メンブレンの作製に成功しているが、1%のLMWHA含有では神経堤細胞株の歯根膜幹細胞分化誘導能が、0%のコントロールと有意差が無かった。一方で2%とした場合には、歯根膜幹細胞分化マーカー遺伝子発現の上昇が認められた。これらの結果から、2%以上の濃度にした場合にはさらに分化誘導能が促進されるとの仮説を立てた。そこで、濃度を4%、5%、6%としたメンブレンの作製を試みた。その結果、4%ではメンブレンが作製可能であった一方、5%以上ではナノファイバーの粘調性が高すぎるため、メンブレンを作製することができなかった。これらの結果を基に、メンブレンに含有するLMWHAの濃度を4%と決定した。
さらに第一三共株式会社との共同研究の下、神経堤細胞株の歯根膜幹細胞分化を誘導する低分子加工物として、C23を同定した。さらにC23と標的を同じくするBiおよびMSCを合成し、それらの歯根膜幹細胞分化誘導能を確認したところ、いずれの低分子化合物も歯根膜幹細胞分化を促進した。また、神経堤細胞株に加え、iPS細胞由来神経堤細胞にC23、Bi、MSCを添加した場合にも、それらの歯根膜幹細胞分化が促進されることを明らかにした。
そこでBiおよびMSCを添加した神経堤細胞株と、未添加の神経堤細胞株を用いてマイクロアレイ解析を行い、遺伝子発現パターンを比較した。その結果、いずれの添加群においても、非添加群と比較して歯根膜細胞マーカーであるFBN1、POSTN,COL1A1、ACTA2、TNN、CD146、CD105などが２倍以上発現上昇していた。さらにCD44、ACAN、ITIH3、HAS1、HAS2などのヒアルロン酸関連遺伝子も発現上昇していた。以上の結果よりLMWHA含有メンブレンの作製および低分子化合物の同定は問題なく進行していると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
生体吸収性メンブレンのLMWHA含有濃度に関しては既に検証を終えており、高濃度の方が歯根膜幹細胞分化誘導能が期待できる反面、5%以上の濃度ではメンブレン化が困難であることを明らかにしている。また、これらの結果を基に、メンブレンのLMWHAの濃度は4%と決定するに至っている。
また低分子化合物も１種類ではなく、同じ標的をもつ２種類を合成した上で新たに検証し、いずれも同じ傾向を示すことを明らかにしている。また細胞も神経堤細胞株だけでなく、ヒトiPS細胞由来神経堤細胞を用いて、それらの歯根膜幹細胞分化を誘導することを確認済みである。これらの結果から、申請者らがターゲットとするシグナル伝達経路が、神経堤細胞の歯根膜幹細胞分化を誘導するものであることを確認できていると言える。
その一方で、メンブレンや低分子化合物の応用では歯根膜組織の再生は可能であっても、広範囲の歯槽骨の再生は困難であるとも考えられる。そこで、歯周組織欠損部位において、歯根膜層頭部には低分子化合物およびLMWHA含有メンブレンを応用することに加え、歯槽骨欠損部位には骨誘導能を有するハイドロゲルの応用を計画している。このハイドロゲルに関しては、共同研究者であるCEU-Cardenal Herrera大学のSalvatore Sauro教授からの提供を受けることになっている。現在、バイオアクティブ能を付与する研究を進めている最中であり、作製が終了し次第本学へと送付してもらい、低分子化合物およびLMWHA含有メンブレンと共に歯周組織へと移植するin vivo実験を開始する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
生体吸収性LMWHA含有メンブレンと低分子化合物の各々を歯周組織欠損モデルラットの欠損部へと移植し、それらの歯周組織再生能を検証する。またメンブレンと低分子化合物を組み合わせた上で移植を行い、それらの相乗効果についても検証を行う。
具体的には、モデルラットの欠損部位へこれらを移植したのち、４週後に屠殺を行う。顎骨を取り出したのち、Micro-CTにて骨量の定量化を行う。また顎骨を包埋したのち切片を作成し、HE染色、マッソントリクローム染色、アリザリンレッド染色、免疫組織化学染色（POSTN、ACTA、ALP、OCN等）を行い、歯根膜組織や歯周組織の再生状態について評価を行う。また好中球の浸潤状態やTNFalphaやIL-6などの炎症性サイトカインの発現状態から、メンブレンや低分子化合物の生体親和性についても評価を行う。
生体吸収性LMWHA含有メンブレンと低分子化合物の歯周組織再生能が確認できた場合、さらなる再生能の向上を目指し、Salvatore Sauro教授からの提供を受けるハイドロゲルと併用し、移植を行った上で、再生能の評価を行う。
これらの実験から、良好な結果が得られた場合には、ラットから大型動物（ウサギ、ブタ、イヌ等）を用いたin vivo実験を行い、歯周組織の再生能や安全背に関する評価を進める。最終的には、本研究をヒトを用いた臨床研究へと発展させる計画である。
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