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Induction of insulin secreting cell via human iPS cells derived from deciduous teeth using a novel organ culture method

Research Project

Project/Area Number 23K24535
Project/Area Number (Other) 22H03277 (2022-2023)
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

Allocation TypeMulti-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023)
Section一般
Review Section Basic Section 57040:Regenerative dentistry and dental engineering-related
Research InstitutionAsahi University

Principal Investigator

齊藤 一誠  朝日大学, 歯学部, 教授 (90404540)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 寺嶋 雅彦  朝日大学, 歯学部, 講師 (20398085)
佐藤 正宏  国立研究開発法人国立成育医療研究センター, ゲノム医療研究部, 共同研究員 (30287099)
稲田 絵美  鹿児島大学, 医歯学域鹿児島大学病院, 講師 (30448568)
薗村 貴弘  朝日大学, 歯学部, 教授 (40347092)
野口 洋文  琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50378733)
照沼 美穂  新潟大学, 医歯学系, 教授 (50615739)
清川 裕貴  朝日大学, 歯学部, 助教 (70980530)
Project Period (FY) 2022-04-01 – 2025-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2024)
Budget Amount *help
¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000)
Fiscal Year 2024: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000)
Fiscal Year 2023: ¥5,460,000 (Direct Cost: ¥4,200,000、Indirect Cost: ¥1,260,000)
Fiscal Year 2022: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000)
Keywords乳歯 / 小児 / iPS細胞 / iTS細胞 / 1型糖尿病 / 膵幹細胞 / 歯髄細胞
Outline of Research at the Start

iPS細胞は体性細胞から樹立され、臨床応用への研究・開発が活発に行われている。しかし、潜在的な奇形腫形成(造腫瘍性)の危惧、特定分化細胞への効率的な分化誘導法の不在など、未だ重要な課題が残る。我々は脱落乳歯の歯髄細胞(HDDPC)由来iPS細胞を用い、世界に先駆けて人工的な膵幹細胞(iTSC-P)を樹立し、これをヌードマウス膵臓内に細胞移植し、造腫瘍性のないインスリン分泌性細胞の長期維持に成功した。そこで本研究では、iTSC-Pを基盤とし、1型糖尿病患者への自家移植可能な安全且つ機能的な新規β細胞分化誘導系の開発を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

1型糖尿病(Type 1 diabetes, T1D)は、膵島に存在するインスリン産生細胞(β細胞)に対する自己免疫疾患である。T1D発生率は国によって異なり、本邦では1年間の新規発症例は約500人とされ、国指定の小児慢性特定疾病である。
一方、「再生医療におけるiPSCから特定の分化組織・細胞を取得する試み」は国内外とも盛んで、本邦では2014年理研にて世界初、iPSC由来網膜細胞の加齢黄斑変性患者への移植手術が行われた。2018年には難治性重症心不全、パーキンソン病、脊髄損傷への臨床研究実施計画も了承された。しかし、国内外とも①潜在的な奇形腫形成(造腫瘍性)の問題と②目的分化細胞への効率的な分化誘導系の確立は依然停滞し、再生医療現場では未だに生体由来の組織性幹細胞(tissue-specific stem cell, TSC)が多用されている。
iPS細胞は体性細胞から樹立され、臨床応用への研究・開発が活発に行われている。我々は侵襲なく取得できるほぼ唯一の生体組織である脱落乳歯の歯髄細胞(HDDPC)由来iPS細胞を用い、世界に先駆けて人工的な膵幹細胞(iTSC-P)を樹立し、これをヌードマウス膵臓内に細胞移植し、造腫瘍性のないインスリン分泌性細胞の長期維持に成功した。この成果により、1型糖尿病患者の乳歯からiPS細胞を経由したiTSC-Pを樹立し、1型糖尿病モデルマウスへの移植により、血糖値改善が可能となる機能的なインスリン分泌β細胞の再生が可能となる。そこで本研究では、iTSC-Pを基盤とし、1型糖尿病患者への自家移植可能な安全且つ機能的な新規β細胞分化誘導系の開発を目指す。本手法はバイオマスとしての乳歯の有用性を証明するだけでなく、患児の乳歯から他臓器へiTSCを利用したテーラーメイド型再生医療にも活用でき、高い汎用性が期待される。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究の初年度において、1型糖尿病患者から得たT1D-HDDPC由来のT1D-iPSCを樹立し、さらにNSCへの転換を目指した。すでに我々が独自でT1D-iPSCは、ヒトiPSCの特徴であるEpi stem cellと同等であり、若干分化している状態である。そのため、さらに脱分化を進め、幹細胞性を高めたNSCの樹立を試みた。具体的には、Inadaらに習い、NSC転換用薬剤含有培地にて継代培養し、iPSCからT1D-NSCへの転換を行った。この過程で台地状であったiPSC colonyは、ドーム型colonyに転換する。ヒトiPSCは本来、SSEA-1抗原を発現しないが、NSCに転換すると、SSEA-1抗原を発現するようになるので、ドーム型colonyがSSEA-1陽性と判断されれば、NSCと判断される。今回樹立したT1D-NSCは、ドーム型colonyを呈し、SSEA-1陽性であったため、その幹細胞特性等を評価した。
2年目の本年度は、T1D-iPSCからNSC転換用薬剤処理でNSCへ転換後、これを非接着性培養皿上で1週間浮遊培養させ、胚様体を形成させた。この過程で、胚様体を構成する細胞では、① β細胞前駆細胞(iTSC-P、あるいはそれに近い細胞)への強制的な分化誘導、②それに伴う残存NSC成分の消失、が期待される。次いで、Kiyokawaらの手法に習い、胚様体を接着性培養皿上に播種し、Wnt3a、activin A含有分化誘導用培地にてiTSC-Pまで分化させた。iTSC-P colonyは、PDX-1などの膵幹細胞特異的マーカー発現をRT-PCR法にて確認した。

Strategy for Future Research Activity

iTSC-Pの特徴は、①奇形腫形成に抵抗性を示し、②in vitroで効率的にグルコース応答性インスリン分泌性β細胞様細胞に分化させることができ、人為的に糖尿病を発症させたヌードマウスへのiTSC-P移植実験から、③iTSC-P移植は、数日間の血糖値改善が可能である。本研究では乳歯由来の材料を用い、効率良くβ細胞を作製し、最終的にはその自家移植によるT1D治療法の開発を目的とした。
2024年度には、樹立したT1D-iTSC-Pの組織学的解析およびqRT-PCR、マイクロアレイなどのmRNA解析に付す。また、抗造腫瘍性確認のため、得られたT1D-iTSC-PをIPPCTにてヌードマウス膵内に移植し、移植後1.5もしくは6ヶ月目に剖検し、造腫瘍性の有無を目視で確認する。大型の固形腫(奇形腫)が確認されない場合、造腫瘍活性は認められないと判断される。一方、移植部位には移植細胞と目される小塊にインスリン産生細胞が含まれるかを、組織学的解析およびqRT-PCR、マイクロアレイなどのmRNA解析に付す予定である。

Report

(2 results)
  • 2023 Annual Research Report
  • 2022 Annual Research Report
  • Research Products

    (10 results)

All 2023 2022 2021

All Journal Article (5 results) (of which Peer Reviewed: 5 results,  Open Access: 5 results) Presentation (5 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results)

  • [Journal Article] Recent Genome-Editing Approaches toward Post-Implanted Fetuses in Mice2023

    • Author(s)
      Nakamura Shingo、Inada Emi、Saitoh Issei、Sato Masahiro
    • Journal Title

      BioTech

      Volume: 12 Issue: 2 Pages: 37-37

    • DOI

      10.3390/biotech12020037

    • Related Report
      2023 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] The Role of Genetically Modified Human Feeder Cells in Maintaining the Integrity of Primary Cultured Human Deciduous Dental Pulp Cells.2022

    • Author(s)
      Ibano N、Inada E、Otake S、Kiyokawa Y、Sakata K、Sato M、Kubota N、Noguchi H、Iwase Y、Murakami T、Sawami T、Kakihara Y、Maeda T、Terunuma M、Terao Y、Saitoh I
    • Journal Title

      Journal of Clinical Medicine

      Volume: 11 Issue: 20 Pages: 6087-6087

    • DOI

      10.3390/jcm11206087

    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Electroporation-Based Non-Viral Gene Delivery to Adipose Tissue in Mice2022

    • Author(s)
      Masahiro Sato、Issei Saitoh、Yuki Kiyokawa、Eri Akasaka、Shingo Nakamura、Satoshi Watanabe、Emi Inada
    • Journal Title

      OBM Genetics

      Volume: 6 Issue: 2 Pages: 18-18

    • DOI

      10.21926/obm.genet.2202151

    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] AP39, a Mitochondrial-Targeted H2S Donor, Improves Porcine Islet Survival in Culture.2022

    • Author(s)
      Misaki Shinzato , Chika Miyagi-Shiohira , Kazuho Kuwae , Kai Nishime , Yoshihito Tamaki , Tasuku Yonaha , Mayuko Sakai-Yonaha , Ikuo Yamasaki , Ryusei Otsuka , Issei Saitoh , Masami Watanabe , Hirofumi Noguchi
    • Journal Title

      Journal of clinical medicine

      Volume: 11.18 Issue: 18 Pages: 5385-5385

    • DOI

      10.3390/jcm11185385

    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Pancreas Preservation in Modified Histidine-lactobionate Solution Is Superior to That in University of Wisconsin Solution for Porcine Islet Isolation2021

    • Author(s)
      Sakai-Yonaha Mayuko、Miyagi-Shiohira Chika、Kuwae Kazuho、Tamaki Yoshihito、Nishime Kai、Yonaha Tasuku、Saitoh Issei、Watanabe Masami、Noguchi Hirofumi
    • Journal Title

      Transplantation

      Volume: Publish Ahead of Print Issue: 9 Pages: 1770-1776

    • DOI

      10.1097/tp.0000000000003636

    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] 乳歯歯髄細胞への高効率な遺伝子導入条件の検討と多機能feeder細胞の樹立2023

    • Author(s)
      井葉野夏実, 清川裕貴, 坂田健輔, 稲田絵美, 大竹慎司, 村上智哉, 澤味規, 岩瀬陽子, 齊藤一誠
    • Organizer
      第61回日本小児歯科学会大会
    • Related Report
      2023 Annual Research Report
  • [Presentation] 新規器官培養系の構築-歯系細胞由来3D構築体作製に向けた予備実験-2023

    • Author(s)
      稲田絵美, 齊藤一誠, 清川裕貴, 井葉野夏実, 山崎要一
    • Organizer
      第61回日本小児歯科学会大会
    • Related Report
      2023 Annual Research Report
  • [Presentation] EXPLORING OF NOVEL REGENERATIVE THERAPIES FOR TYPE 1 DIABETES USING “INDUCED TISSUE-SPECIFIC STEM CELL -PANCREASE (ITSC-P)”2023

    • Author(s)
      Yuki Kiyokawa, Natsumi Ibano, Kensuke Sakata, Ryo Bando, Tadashi Sawami, Yoko Iwase, Yasuo Tamura, Issei Saitoh
    • Organizer
      第29回国際小児歯科学会大会
    • Related Report
      2023 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] A Case of Improved ectopic Eruption in a Child with Congenital Heart Disease2023

    • Author(s)
      Yuki Kiyokawa, Reira Ukai, Akiko Ohshima, Asami Fukui, Yasutaka Kaihara, Emi Inada, Yukiko Nogami, Tadashi Sawami, Yoko Iwase, Issei Saitoh
    • Organizer
      Korean Academy of Pediatric Dentistry
    • Related Report
      2023 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 糖尿病患児由来乳歯歯髄細胞を用いた膵臓特異的幹細胞(T1D-iTSC-P)の樹立2022

    • Author(s)
      清川裕貴,稲田絵美,井葉野夏実,安村真一,岡野 哲,岩瀬陽子,早﨑治明,齊藤一誠
    • Organizer
      第60回日本小児歯科学会大会
    • Related Report
      2022 Annual Research Report

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Published: 2022-04-19   Modified: 2024-12-25  

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