| Project/Area Number |
23K24535
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| Project/Area Number (Other) |
22H03277 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 57040:Regenerative dentistry and dental engineering-related
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| Research Institution | Asahi University |
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Principal Investigator |
齊藤 一誠 朝日大学, 歯学部, 教授 (90404540)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
寺嶋 雅彦 朝日大学, 歯学部, 講師 (20398085)
佐藤 正宏 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, ゲノム医療研究部, リサーチアソシエイト (30287099)
稲田 絵美 鹿児島大学, 医歯学域鹿児島大学病院, 講師 (30448568)
薗村 貴弘 朝日大学, 歯学部, 教授 (40347092)
野口 洋文 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50378733)
照沼 美穂 新潟大学, 医歯学系, 教授 (50615739)
清川 裕貴 朝日大学, 歯学部, 助教 (70980530)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000)
Fiscal Year 2024: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000)
Fiscal Year 2023: ¥5,460,000 (Direct Cost: ¥4,200,000、Indirect Cost: ¥1,260,000)
Fiscal Year 2022: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000)
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| Keywords | 乳歯 / 小児 / 1型糖尿病 / iTS細胞 / iPS細胞 / 膵幹細胞 / 歯髄細胞 |
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| Outline of Research at the Start |
iPS細胞は体性細胞から樹立され、臨床応用への研究・開発が活発に行われている。しかし、潜在的な奇形腫形成（造腫瘍性）の危惧、特定分化細胞への効率的な分化誘導法の不在など、未だ重要な課題が残る。我々は脱落乳歯の歯髄細胞（HDDPC）由来iPS細胞を用い、世界に先駆けて人工的な膵幹細胞（iTSC-P）を樹立し、これをヌードマウス膵臓内に細胞移植し、造腫瘍性のないインスリン分泌性細胞の長期維持に成功した。そこで本研究では、iTSC-Pを基盤とし、１型糖尿病患者への自家移植可能な安全且つ機能的な新規β細胞分化誘導系の開発を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
iPS細胞は体性細胞から樹立され、臨床応用への研究・開発が活発に行われている。しかし、潜在的な奇形腫形成（造腫瘍性）の危惧、特定分化細胞への効率的な分化誘導法の不在など、未だ重要な課題が残る。我々は侵襲なく取得できるほぼ唯一の生体組織である脱落乳歯の歯髄細胞（HDDPC）由来iPS細胞を用い、世界に先駆けて人工的な膵幹細胞（iTSC-P）を樹立し、これをヌードマウス膵臓内に細胞移植し、造腫瘍性のないインスリン分泌性細胞の長期維持に成功した。この成果により、１型糖尿病（Type 1 diabetes、T1D）患者の乳歯からiPS細胞を経由したiTSC-Pを樹立し、T1Dモデルマウスへの移植により、血糖値改善が可能となる機能的なインスリン分泌ベータ細胞の再生が可能となる。本手法はバイオマスとしての乳歯の有用性を証明するだけでなく、患児の乳歯から他臓器へiTSCを利用したテーラーメイド型再生医療にも活用でき、高い汎用性が期待されている。
一方、「再生医療におけるiPSCから特定の分化組織・細胞を取得する試み」については、国内外とも①潜在的な奇形腫形成（造腫瘍性）の問題と②目的分化細胞への効率的な分化誘導系の確立は依然停滞し（問題点）、再生医療現場では未だに生体由来の組織性幹細胞（tissue-specific stem cell, TSC）が多用されている。「iPSCへの巨額な研究費投入にも拘わらず、なぜ上記問題を克服できないのか？」が、本研究の核心をなす学術的な「問い」であった。そこで本研究課題では、T1D患児由来乳歯歯髄細胞 （T1D-HDDPC）を用い、ベータ細胞への分化特性を潜在的に有するInduced Tissue-Specific Stem cell（iTSC）を人工的に作製し、T1Dの新規再生治療法を提示することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
T1Dは、膵臓の インスリン産生細胞（ベータ細胞）が自己免疫により破壊され、インスリンが枯渇することで血糖値調整が困難となる疾患で、小児慢性特定疾病に指定される。また糖尿病により、歯周炎の増悪、唾液分泌量の低下、創傷治癒遅延などを生じるため、 長期の歯科的管理が必要である。T1Dの治療法は、インスリン注射での対症療法が主であり、抜本的な治療法はいまだになく、新たな再生療法の開発が急がれる。
本研究では、下記のごとく新規ベータ細胞分化誘導系の開発を行った。
T1D患児の脱落乳歯から歯髄組織を採取し、collagenase Type 1とdispaseで酵素処理しT1D-HDDPCの単離を行った。電気穿孔法にて、T1D-HDDPCに対し、初期化因子を遺伝子導入し、T1D-HDDPC-iPSCを作製した。その後、Forslokinなどを含む未分化転換培地で培養し、未分化状態を進めナイーブ化させたT1D HDDPC-NSCを作製した。さらに、in vitroにてactivin Aなどを含むRPMI培地で段階的に分化誘導し、世界に先駆けてT1D患児由来のT1D-iTSC-Pを樹立した。
Balb/c nudeマウスに対し、麻酔後に開腹し、実体顕微鏡下にて呼気制御性ガラスピペット法を用いて、T1D-iTSC-Pを膵臓内に少量移植した。1.5カ月後に、移植部組織を採取し、免疫染色を行った。RT-PCR解析にて、T1D-iTSC-Pにおいて、幹細胞マーカー（OCT3/4、SOX2等）と膵臓マーカー（インスリン、PDX1）の遺伝子発現を認めた。免疫染色では、T1D-iTSC-Pではインスリンと膵臓組織特異的マーカーの発現を認めた。マウスへの細胞移植では、腫瘍形成を認めず、膵島様組織の再生を認めた。
現在は、T1D-iTSC-Pのインスリン分泌能について評価しており、同時に論文作成中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
iTSCは我々が世界に先駆けて樹立した人工的組織幹細胞であり、「部分的なリプログラミング」という概念を世界で初めて提唱したことから、学術的な独自性は高い細胞である。また、iTSCを経由した再生医療は、iPSCの問題点である安全性（造腫瘍性への不安）や目的組織/細胞への分化誘導法の不在を回避することができる。また、乳歯から糖尿病の改善を目指す本研究は、「口腔は重要な消化器官であることの証明」にもつながり、創造性に富むと確信する。
本研究課題の成果として、当該細胞はT1D-iTSC-Pは幹細胞特性と膵臓特性を併せ持ち、インスリン分泌可能な未成熟なベータ細胞様細胞と考えられる。このことは、T1D患児由来細胞の自家移植による、抗腫瘍性で安全なベータ細胞再生の可能性を示しており、T1Dの根治的療法および再生医療における活用が大いに期待された。
さらに、我々はHDDPCを細胞ソースとし、iPSC・NSCを経由した膵臓だけでなくその他の組織に関する人工的組織幹細胞の樹立を目指し研究を開始している。さらに、マイクロピペットを用い細胞への移植が可能な独自の膵内移植法（IPPCT）などは、少量の細胞をレシピエント組織へ移植・定着が可能であり、様々な研究の発展が期待できる。今後は、細胞移植だけでなく、T1D-iTSC-P を用いたin vitroでの三次元構造体である組織特異的オルガノイド形成を経由し、レシピエント組織への移植片への定着を目指し、研究を同時に進めて行く予定である。
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