Role of newly-identified fibroblast-like cells in peripheral nereve regeneration

• Project/Area Number: 23K24545
• Project/Area Number (Other): 22H03287 (2022-2023)
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund (2024); Single-year Grants (2022-2023)
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 57060:Surgical dentistry-related
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 前田 健康 新潟大学, 医歯学系, 教授 (40183941)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐藤 友里恵 (山田友里恵) 新潟大学, 医歯学系, 助教 (20804537) ; 瀬尾 憲司 新潟大学, 医歯学系, 教授 (40242440)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥17,680,000 (Direct Cost: ¥13,600,000、Indirect Cost: ¥4,080,000); Fiscal Year 2024: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2023: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000); Fiscal Year 2022: ¥8,710,000 (Direct Cost: ¥6,700,000、Indirect Cost: ¥2,010,000)
• Keywords: 末梢神経 / 再生 / 血管関連神経内膜線維芽細胞様細 / 神経血管ワイヤリング / 血管周囲細胞 / 神経再生 / 血管 / 血管関連神経内膜線維芽細胞様細胞

Outline of Research at the Start

我々が報告したマウス坐骨神経損傷モデルを用いて，末梢神経再生時の血管関連神経内膜線維芽細胞様細胞(bvEFLC)の役割ならびにbvEFLCと血管内皮細胞間の相互作用と末梢神経再生過程へ関わりを明らかにする。研究目標は，①血管とbvEFLCの神経再生時の三次元的・経時的位置関係の解明，②パブリックシングルセルR N AseqデータベースによるbvEFLCの発現遺伝子の分析，③損傷神経によるbvEFLCの遺伝子解析，④bvEFLC培養条件の検討と機能解析，⑤bvEFLCコンディショナルノックアウトマウス(bvEFLCcKO)の樹立，⑥bvEFLCcKOの血管新生および神経再生の評価である.

Outline of Annual Research Achievements

昨年度作製したbvEFLCレポーターマウス（以下bvEFLC tomatoマウス）を順調に繁殖し、実験を行うに十分なサンプル数を得ることができた。bvEFLC tomatoマウスの坐神経を損傷し、損傷後１、３、５、７、１４、２８日に損傷坐骨神経を摘出した。摘出したサンプル全体を組織透明化試薬で透明化し、共焦点顕微鏡でbvEFLCの分布の変化の観察を試みた。透明化による蛍光強度の著しい減衰は認められなかった。しかし、共焦点顕微鏡ではレーザーが坐骨神経の深部に到達せず、ホールサンプルにおけるbvEFLCの分布を観察できなかった。そこで現在、現在多光子顕微鏡を用いてより深い部位の観察を試みている。また、bvEFLCマウスと神経特異的に緑色蛍光蛋白（GFP）を発現するマウス(Thy１-GFPマウス)を交配し、bvEFLCと神経がそれぞれ異なる色で識別できるマウス(bvEFLC-tomato Thy1-GFPマウス)を作製した。これにより、生きたマウスの生体内でbvEFLCと軸作の関係性をより詳細に観察することが可能になった。bvEFLC-tomato Thy1-GFPマウスも同様に神経損傷を施し、損傷坐骨神経で透明化ホールマウントサンプルを作製し、再生軸索とbvEFLCの位置関係の観察を試みている。また、bvEFLCの神経再生への影響を調べるために、ジフテリア毒素受容体遺伝子(DTR)を， bvEFLC特異的に発現させたマウス（bvEFLC-DTR Thy1-GFPマウス）を作製した。現在このマウスにジフテリアトキシンを投与し、bvEFLCを除去した状態における再生軸作の伸長の観察を試みている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度の研究により、現段階で必要な全ての遺伝子改変マウスの樹立が完了した。また、本年度に計画していた実験は着手できており、本研究の中心となる実験方法もトラブルシュートが順調に進み、ほぼ確立できているため。

Strategy for Future Research Activity

当初の研究計画に則した実験を行う。多光子顕微鏡を用いた損傷坐骨神経のホールサンプルの観察を続ける。bvEFLC tomatoマウスの損傷神経の経時的観察により、bvEFLCが最も活発に細胞動態を変化させるタイムポイントを見つける。その時点での再生軸作をbvEFLC-tomato Thy1-GFPマウスとbvEFLC-DTR Thy1-GFPマウスで比較する。また、bvEFLC-DTR Thy1-GFPマウスの損傷神経の長期的な機能回復を観察するために、神経損傷後９０日後に神経伝導速度試験と運動機能の評価（ワイヤーハングテスト、ローターロッドテスト、テールフリックテスト）を行う。