| Project/Area Number |
23K24554
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| Project/Area Number (Other) |
22H03296 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 57070:Developmental dentistry-related
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| Research Institution | Kyushu University (2024)
Tohoku University (2022-2023) |
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Principal Investigator |
山田 亜矢 九州大学, 歯学研究院, 准教授 (40295085)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉崎 恵悟 九州大学, 大学病院, 講師 (10507982)
福本 敏 九州大学, 歯学研究院, 教授 (30264253)
千葉 雄太 東北大学, 歯学研究科, 講師 (10821986)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,160,000 (Direct Cost: ¥13,200,000、Indirect Cost: ¥3,960,000)
Fiscal Year 2026: ¥2,730,000 (Direct Cost: ¥2,100,000、Indirect Cost: ¥630,000)
Fiscal Year 2025: ¥2,730,000 (Direct Cost: ¥2,100,000、Indirect Cost: ¥630,000)
Fiscal Year 2024: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000)
Fiscal Year 2022: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
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| Keywords | 歯の発生 / エナメル質 / エナメル芽細胞 / 歯原性上皮細胞 / 免疫 / 歯 / NFkB / 組織再生 / 歯の形成不全 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、NFkB経路を中心とした免疫関連シグナルが、歯の形態形成に及ぼす影響を明らかするとともに、これら分子が歯関連細胞内において、免疫調節機構にどのように関わっているかを把握し、上皮陥入組織における形態形成機構と免疫クロストークを明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
歯の発生は上皮細胞と間葉細胞との相互作用によって行われ、この相互作用によって歯の形態や大きさが規定されていると考えられている。歯の大きさに異常を示す疾患として、外胚葉異形成症があり、本疾患においてはリガンドであるEDAや、その受容体であるEDAR遺伝子に変異を生じていることが明らかとなっている。このEDA-EDARの下流分子は、NF-kB経路であり、これらは免疫反応に関連するシグナル経路であることから、歯の発生と免疫システムとのクロストークが存在することが示唆された。
これまでNF-kB経路の分子として、p50、p52及びNIKの遺伝子変異マウスを用いた歯の形態形成の解析を行なってきており、これらのシグナル経路が歯胚上皮細胞におけるShhとWnt7bの発現制御と、内エナメル上皮での細胞増殖の濃淡を生じることで、複雑な歯の形態を形成していることが明らかとなった。そこでShhやWnt7bが歯胚においてどのような細胞に作用し、歯の大きさをコントロールしているのかを明らかにするために、歯を構成する内エナメル上皮、外エナメル上皮、中間層細胞、星状網細胞に特異的に発現し、歯の大きさ決定に関わる分子のスクリーニングを、シングルセルRNAシークエンスを用いて解析した。その結果、外エナメル上皮におけるKrt15の発現が歯の大きさ制御に関わっていることが明らかになった。また内エナメル上皮の細胞増殖に関わる転写因子AmeloDが、細胞内で直接Wntシグナル分子の一つであるTCFに結合することを、タンパク相互作用実験により明らかとした。これらの結果から、Shh及びWnt7bがKrt15の発現制御や、Krt15による細胞増殖制御に、また内エナメル上皮においてWnt7b刺激が、AmeloD-TCFの相互作用に関与し、細胞増殖を制御している可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
歯の発生におけるShh及びWnt7bの役割、特に歯原性上皮細胞における細胞増殖制御を明らかにするために、歯原性上皮細胞SF2細胞を用いたRNAシークエンスにより解析を進める予定であった。同時に解析を進めていた歯の発生段階の各ステージにおけるシングルセルRNAシークエンスデータの解析や酵母のtwo-hybrid解析から、歯の大きさの決定に関わるKrt15やTCFの同定が行えた。さらにKrtやTCFファミリー全体の歯胚における発現パターンを明らかにすることができたことから、Shh及びWnt7b刺激によるKrt15陽性細胞の反応性や、TCFによる遺伝子転写制御を検討することとした。
さらにこれら増殖因子の刺激に関しては、上皮細胞における細胞間結合が重要であり、細胞間結合分子の発現量に応じ、細胞増殖が大きく変化することが明らかとなった。本研究期間内の、歯胚の大きさに関連した多くの分子の同定に成功してきたことから、予想外の新たな知見の積み上げができた。一方で、具体的にこれらの因子がShh及びWnt7b刺激においてどのように関わっているのかは、本研究期間内に明らかにすることができなかった。以上の結果から、「概ね順調に進展している」との判断となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究に関しては、歯原性上皮細胞SF2細胞を用いたin vitro実験、マウス歯胚の器官培養を用いたex vivo実験を中心に進めていく予定である。
１）Shh及びWnt7bのKrt15（-）SF2細胞とKet15（+）SF2細胞における細胞増殖制御機構の解明：SF2細胞は通常Krt15陰性であることから、本細胞にKrt15遺伝子を過剰発現させた安定発現細胞株を作成する。本細胞にShhあるいはWnt7bを添加し、細胞増殖への影響を評価する。この際に、ShhあるいはWnt7bの添加の有無によりmRNAを採取し、RNAシークエンスを用いて、発現変化のあった分子のスクリーニングと機能解析を行う。
２）Wnt7b刺激によるAmeloD-TCFのクロストークの解明と細胞増殖制御機構の解明：SF2細胞にAmeloDを過剰発現させ安定発現細胞株を作成する（作成済）。作成した細胞株にWnt7bにて刺激を行い、AmeloDの有無による細胞増殖の変化を検討する。さらにWnt7bの下流シグナル分子であるTCF（本研究ではTCF4を想定）の核移行状況やTCFと結合するbeta-cateninとの結合割合や、標的遺伝子の転写活性を検討する。これらの相互作用と転写活性が、細胞の増殖とどのように関連するのかを明らかにする。
３）siRNA-Krt15を用いた歯胚器官培養におけるShh及びWnt7b刺激による歯胚形態形成の評価：胎生14日のマウス歯胚の器官培養系において、siRNA-Krt15を添加し、歯胚組織内での細胞増殖について、Ki67による免疫染色及びEdUの取り込み能を用いて評価する。この器官培養系のShh及びWnt7bの刺激による歯胚形態の変化を評価する。歯の形態に差の認められた群に関しては、シングルセルRNAシークエンスを用いて、細胞増殖に変化を起こした細胞の同定と遺伝子発現評価を行う。
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