| Project/Area Number |
23K24768
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| Project/Area Number (Other) |
22H03511 (2022-2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2022-2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 59040:Nutrition science and health science-related
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
岡村 裕彦 岡山大学, 医歯薬学域, 教授 (20380024)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
十川 千春 広島工業大学, 生命学部, 教授 (10253022)
江口 傑徳 岡山大学, 医歯薬学域, 准教授 (20457229)
大森 一弘 岡山大学, 医歯薬学域, 准教授 (20549860)
池亀 美華 岡山大学, 医歯薬学域, 准教授 (70282986)
福原 瑶子 (内田瑶子) 岡山大学, 医歯薬学域, 助教 (60779742)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥17,160,000 (Direct Cost: ¥13,200,000、Indirect Cost: ¥3,960,000)
Fiscal Year 2025: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2024: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
Fiscal Year 2022: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
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| Keywords | 細胞外小胞 / 歯周病 / 胎盤 / 胎児 / VEGFR1 / マクロファージ / 歯周病原菌 / 細胞外分泌小胞 / 発育 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では，「歯周病（原菌）が胎盤と胎児の組織形成にどのような機序で影響を及ぼすか」について，『細胞外分泌小胞』に着目して解明を行う。歯周病原菌が感染したマクロファージ由来の『細胞外分泌小胞』が胎盤および胎児に移行し，著しい成長阻害を誘導することを見出した。『細胞外分泌小胞』が胎盤や胎児の組織形成に与える影響について，質量分析，細胞組織学的手法，イメージング技術を用いて解析する。本研究成果を基に，母子の健康状態の維持と正常な成長発育における理想的な口腔環境の構築を目指し，健康医学に貢献する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
胎盤は母体と胎児を結び，血液を介して栄養・代謝物，ガスの交換を行う精密な組織である。胎盤は小分子の通過を制御して母体の健康状態と胎児の成長発育において重要な役割を担っている。歯周病は口腔のみならず全身の健康状態に影響を及ぼす炎症性疾患である。妊娠中の母体が歯周病に罹患すると，母体の高血圧や腎臓・肝臓の機能障害などの疾患のみならず胎児の成長発育を阻害するが，その詳細な分子機構は分かっていなかった。本研究では，『細胞外分泌小胞』の組織障害性とその動態に着目して，歯周病（原菌）が胎盤と胎児の成長を阻害する分子メカニズムを解明することを目指した。ヒト培養単球細胞をマクロファージに分化させた。歯周病原菌である Porphyromonas gingivalis（Pg）を感染させたマクロファージから培養上清中に分泌された『細胞外分泌小胞』（Extracellular Vesicles: EVs）を回収する。これを「歯周病原菌が感染したマクロファージ由来の『細胞外分泌小胞』（Pg-inf MΦ EVs ）」と定義した。妊娠マウスにPg-inf MΦ EVsを投与した。胎盤と胎児を摘出し，組織切片をHE染色し，胎盤を構成する細胞の形態や血管構造をコントロール群と比較して観察した。胎盤では，炎症性反応は認められなかったが，明らかな血管構造の乱れが生じていた。Pg-inf MΦ EVs 投与群の胎児の成長発育について解析するため，骨格透明標本（骨・軟骨を染色後に透明化）を作製した。また，各臓器からRNAを抽出し，分化マーカーの発現をqPCRで比較検討し，各臓器の形成・発達度や骨形成度に対するPg-inf MΦ EVs の影響を調べた。分化マーカーの発現には有意な差がなかった。Pg-inf MΦ EVs は胎盤の血管構造に影響し，胎児の成長発育を阻害すると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通りの実験を行い，データを得ている。特に，歯周病原菌である Porphyromonas gingivalis（Pg）を感染させたマクロファージから培養上清中に分泌された『細胞外分泌小胞』（Extracellular Vesicles: EVs）を回収し，妊娠マウスに投与したところ，血管形成に大きな差が認められたことは特筆したい。胎児に関しても，骨格標本を作製し，形態的な解析を行なえた。
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| Strategy for Future Research Activity |
胎盤組織の蛋白質の抽出と質量分析による解析を行う計画をしている。胎盤組織をホモジナイズし，蛋白質を抽出する。一方，数ミリ角にした胎盤組織を培養液中で数時間培養し，その上清中に放出される『組織由来の細胞外分泌小胞』を回収する。これらのサンプルに含有される蛋白質の種類と量を世界最高水準の質量分析器を用いて網羅的に解析する（協力：がん研究会・植田幸嗣博士）。得られたデータについてプロテオミクス解析することで，Pg-inf MΦ EVs が胎盤組織・細胞の遺伝子・蛋白質の発現にどのような影響を与えるか調べる。胎盤組織の形成には秩序だった血管形成や配列が重要とされており，血管形成関連因子（VEGF, Angiogeninなど）に着目している。また，『細胞外分泌小胞』の標識とナノ粒子アナライザー・質量分析器による解析も計画している。回収した『細胞外分泌小胞』を MΦ の特異的なマーカーであるCD11b抗体（FITCにより緑色蛍光標識）と歯周病菌固有の病原因子であるジンジパインに対する抗体（赤色蛍光標識）と反応させる。このサンプルを次世代ナノ粒子アナライザーであるNanoFCM（協力：メイワフォーシス社）を用いて解析する。緑色のみポジティブな『細胞外分泌小胞』は Pg が感染していない MΦ EVs，一方，緑色・赤色の両方ポジティブな『細胞外分泌小胞』はPg-inf MΦ EVsと判別できる。さらに，回収したPg-inf MΦ EVsについて，前述の質量分析器を用いて含有される蛋白を網羅的に調べる。得られたデータを基に，歯周病の病態と『細胞外分泌小胞』の量的・質的変化との関連性を評価する。
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