Establishment of a method to reduce ischemia-reperfusion injury using ultrafine bubbles

Research Project

Project/Area Number	23K25234
Project/Area Number (Other)	22H03980 (2022-2023)
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Allocation Type	Multi-year Fund (2024) Single-year Grants (2022-2023)
Section	一般
Review Section	Basic Section 90130:Medical systems-related
Research Institution	Aichi Medical University
Principal Investigator	内藤宗和愛知医科大学, 医学部, 教授 (10384984)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	福重香愛知医科大学, 医学部, 講師 (30805023) 三崎伯幸香川大学, 医学部附属病院, 講師 (50452678) 西澤祐吏国立研究開発法人国立がん研究センター, 東病院, 医員 (50545001) 横田紘季名城大学, 理工学部, 助教 (50815876) 畑山直之愛知医科大学, 医学部, 准教授 (80534792) 荒木淳静岡県立静岡がんセンター(研究所), その他部局等, 研究員 (00508088) 田上辰秋名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(薬学), 准教授 (10609887)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2026-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2024)
Budget Amount *help	¥16,510,000 (Direct Cost: ¥12,700,000、Indirect Cost: ¥3,810,000) Fiscal Year 2025: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000) Fiscal Year 2024: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000) Fiscal Year 2023: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2022: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Keywords	超微細気泡 / 再灌流障害 / メディカルガス
Outline of Research at the Start	一酸化炭素（CO）と水素（H2）は虚血再灌流障害に対する予防・治療効果を持つガスとして知られている。最近、申請者らは、COを内封した直径約100nmの超微細気泡を無菌で作製する技術を独自に開発し、細胞・臓器の保存時間の延長および移植後再灌流障害の軽減に成功した。そこで、本申請課題では、UFBを用いた虚血再灌流障害の軽減方法を確立するため、ヒト培養細胞（in vitro）と臓器灌流法（ex vivo）を用いてこの方法の至適条件を検討し、UFBの作用機序の解明に迫りたい。また、大動物（in vivo）を用いてこの方法の有効性および安全性を検証し、臨床応用への展開に繋げる計画である。
Outline of Annual Research Achievements	独自に開発したベンチュリー式UFB作製装置で空気を含有するUFBを作成した。溶媒として、蒸留水、生理食塩水、グルコース溶液を用いた。各種UFBの粒子数濃度とサイズをナノトラッキング粒子径測定装置で評価した。また、UFBに対する凍結・融解の影響を明らかにするため、緩慢凍結（-4℃、-30℃）あるいは、急速凍結（液体窒素）させたUFB含有溶液を融解し、前後の変化を比較した。その結果、蒸留水と生理食塩水で作成したUFBのサイズは、それぞれ142.7±73.0、142.6±52.4 (nm)であり、粒子濃度はそれぞれ2.4、2.6 (109 Particles/ml)であった。グルコースの濃度上昇に伴い、グルコース溶液中のUFBの粒子数濃度が増加した。また、緩慢凍結後に融解したUFBの数濃度は10分の1程度まで減少した一方で、急速凍結後に融解したUFBの粒子数濃度はほとんど変わらなかった。また、それらのUFBに対して、種々の界面活性剤（カチオン性、アニオン性、ノニオン性）及び界面活性作用を有する生体内タンパク質を添加した際の、粒子径、粒度分布、ゼータ電位等を評価した。その結果、独自装置によって作成したUFBはいずれの溶媒においても約150nm程度であり、安定的に作成可能であった。ゼータ電位は界面活性剤等の添加により変化がみられた。イオン性界面活性剤を添加した場合、界面活性剤の電荷依存的に、UFBの電荷に変化がみられたが、濃度依存性はみられなかった。一方、ノニオン性界面活性剤を添加した場合、濃度依存的にUFB固有のマイナス電荷の低下がみられた。これらの結果より、UFBに界面活性剤等を添加することにより、UFB表面へと作用していることが明らかとなった。これらはUFBの医療応用のための薬剤化に向け、有用な知見であると思われる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ウルトラファインバブル(UFB)の効果を実証するためには、UFBの作成技術を見直す必要があることが明らかになった。
Strategy for Future Research Activity	ウルトラファインバブル(UFB)の作成技術の見直しを行い、並行して細胞レベルの実験と動物レベルでの実験を行っていく予定である。具体的には、ベンチュリー式UFB作製装置に加えて、循環式の作成装置を開発し、大量のUFBを安定的に作成することを目指す。また、作成したUFBを観察するために、現在使用しているナノ粒子解析システム NanoSight NS300だけでなく、分子間力顕微鏡を用いてUFBの実態を視覚化することを計画している。