Evolutionary engineering of yeast metabolisms using metabolite sensors

• Project/Area Number: 23K26469
• Project/Area Number (Other): 23H01776 (2023)
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund (2024); Single-year Grants (2023)
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 27040:Biofunction and bioprocess engineering-related
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 石井 純 神戸大学, 先端バイオ工学研究センター, 准教授 (40512546)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2027-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥18,590,000 (Direct Cost: ¥14,300,000、Indirect Cost: ¥4,290,000); Fiscal Year 2026: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2025: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2024: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2023: ¥5,720,000 (Direct Cost: ¥4,400,000、Indirect Cost: ¥1,320,000)
• Keywords: 合成生物学 / 代謝工学 / 進化工学 / メタボライトセンサ / 酵母

Outline of Research at the Start

本研究では、代謝工学に進化工学を組み入れた“代謝進化工学”という概念を発展させるため、合成生物学の技術をベースとした微生物の代謝経路や酵素を迅速に最適化するための新たな手法を開発する。これまでに開発してきた人工転写因子型およびGPCR型の酵母メタボライトセンサを用いることで、膨大なライブラリから代謝向上株の選抜が可能となり、代謝や酵素の進化工学を推進することができる。具体的には、代謝酵素群の遺伝子ソース探索や発現量バランスの最適化など、多様な候補・組み合わせを発生させた中から最適解を見出す進化工学ベースの代謝改変の方法論を構築する。

Outline of Annual Research Achievements

メタボライトセンサを利用した代謝進化工学系の基礎を確立するために、これまで開発を進めてきた人工転写因子およびGタンパク質共役型受容体(GPCR)を利用したメタボライトセンサを用いて、目的とする代謝物を検出できるレポーターアッセイ系を構築した。また、レポーターとして緑色蛍光タンパク質（GFP）の蛍光強度を指標にして、目的とする各種の代謝物の濃度を簡易的に評価できる系を構築した。目的代謝物の外来生合成経路の酵素群を酵母に導入し、さらに加えた代謝経路の中での律速点を調べるために、それらの酵素群を異なる発現強度をもつプロモータセットを用いて追加で強発現する組み合わせを発生させたライブラリを構築し、前述のメタボライトセンサによるアッセイ系を利用して目的代謝物の生産性を網羅的に評価した。また、目的代謝経路中の酵素遺伝子群のコピー数をランダム化したライブラリを構築し、同様にメタボライトセンサを用いて高生産株スクリーニングを行った。スクリーニングにより取得した菌株の中から高い蛍光強度を示す組換え体を選別して、生育や生産性を詳細に評価した。さらに、導入された遺伝子やプロモータのシーケンス解析を実施し、最適な発現バランスや律速となる酵素遺伝子の同定を行った。これらの研究を通じて、メタボライトセンサを利用した代謝進化工学系のプロトタイプを構築した。これらの成果について、国内外の学会および研究会において発表を行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

目的とする代謝物に対して、それぞれ人工転写因子およびGタンパク質共役型受容体(GPCR)を利用したメタボライトセンサを構築し、多様性を発生させるライブラリを構築してスクリーニングが可能なことを示した。以上のように、研究は計画通り順調に進展している。

Strategy for Future Research Activity

これまでに開発してきたメタボライトセンサと高速スクリーニング用の評価系を用いて、さらなる代謝進化工学の基盤を高度化する。また、メタボライトセンサ自体の高度化を進めるとともに、ライブラリ多様性の発生手法についても開発を進める。これらの研究を通じて、メタボライトセンサを用いた酵母の代謝進化工学系の確立を目指す。

Research Products

• [Int'l Joint Research] 国立清華大学（National Tsing Hua University）(その他の国・地域：台湾)
• [Journal Article] ピキア酵母の多重遺伝子欠損による難分泌性抗体タンパク質の生産性向上 (2023)
  • Author(s): 伊藤洋一郎，石井純，近藤昭彦
  • Journal Title: バイオサイエンスとインダストリー Volume: 81 Pages: 234-236
• [Presentation] 微生物代謝の理解と最適化に向けたバイオDX基盤の構築 (2023)
  • Author(s): 石井純
  • Organizer: 第75回日本生物工学会大会 シンポジウム（生命科学研究の革新に向けたバイオDXの挑戦）
  • Invited
• [Presentation] Development of genetic engineering tools for synthetic biology and cell factories in yeasts (2023)
  • Author(s): Jun Ishii
  • Organizer: 2023 Asian Synthetic Biology Association (ASBA) Meeting (ASBA2023)
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 酵母の高発現性人工誘導プロモータの開発 (2023)
  • Author(s): 冨永将大,伊藤洋一郎,近藤昭彦,石井純
  • Organizer: 第75回日本生物工学会大会
• [Presentation] 高発現性の酵母人工誘導プロモータの開発 (2023)
  • Author(s): 冨永将大,伊藤洋一郎,近藤昭彦,石井純
  • Organizer: 第3回神戸大学先端バイオ工学研究センター成果発表会
  • Invited
• [Presentation] ピキア酵母におけるターミネーター置換での遺伝子発現量制御 (2023)
  • Author(s): 伊藤洋一郎,寺井悟朗,石上美佐,橋場倫子,中村泰之,番場崇弘,雲北涼太,蓮沼誠久,浅井潔,石井純,近藤昭彦
  • Organizer: 第75回日本生物工学会大会
• [Presentation] バクテリオファージ由来RNAポリメラーゼを利用した酵母遺伝子スイッチの開発 (2023)
  • Author(s): 堀智彦,冨永将大,梶亘佑,近藤昭彦,石井純
  • Organizer: 第75回日本生物工学会大会
• [Presentation] バクテリオファージ由来の転写系を利用した酵母遺伝子スイッチの構築 (2023)
  • Author(s): 堀智彦,冨永将大,梶亘佑,近藤昭彦,石井純
  • Organizer: 日本農芸化学会関西支部第528回講演会
• [Presentation] バクテリオファージ由来転写系を利用した酵母遺伝子スイッチの開発 (2023)
  • Author(s): 堀智彦,冨永将大,梶亘佑,近藤昭彦,石井純
  • Organizer: 第3回神戸大学先端バイオ工学研究センター成果発表会
• [Presentation] T7ファージ由来の転写系を利用した酵母遺伝子スイッチの開発 (2023)
  • Author(s): 堀智彦,冨永将大,梶亘佑,近藤昭彦,石井純
  • Organizer: 神戸大学研究基盤センター 若手フロンティア研究会2023
• [Patent(Industrial Property Rights)] 高効率な酵母遺伝子系 (2023)
  • Inventor(s): 冨永将大，石井純，近藤昭彦，堀智彦
  • Industrial Property Rights Holder: 国立大学法人神戸大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2023-218699
  • Filing Date: 2023