| Project/Area Number |
23K26517
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| Project/Area Number (Other) |
23H01824 (2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 28050:Nano/micro-systems-related
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
鈴木 雅登 兵庫県立大学, 理学研究科, 准教授 (60574796)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安川 智之 兵庫県立大学, 理学研究科, 教授 (40361167)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥19,110,000 (Direct Cost: ¥14,700,000、Indirect Cost: ¥4,410,000)
Fiscal Year 2025: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2024: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2023: ¥10,010,000 (Direct Cost: ¥7,700,000、Indirect Cost: ¥2,310,000)
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| Keywords | 電気回転 / 単一細胞解析 / 細胞膜容量 / サイトカイン / T細胞 / リポソーム / 誘電泳動 / 電気形成 / リン脂質 / 膜容量 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究課題は、細胞の外部刺激（薬剤、抗体、異物）に対する応答から、細胞外へのサイトカインの分泌までの一連の細胞の機能を単一細胞レベルで、簡便・非標識に計測するウエル型単一細胞分析デバイスの確立を目的にする。外部刺激に対する個々の単一細胞の応答を一括電気回転法によって非標識に検出し、刺激に応答して分泌されたサイトカインをウエル上面に配置した「フタ」に吸着させ、その分泌量を計測する。そして、回転速度とサイトカインの分泌量の相関関係を明らかにして、刺激に対する細胞の電気回転速度の変化量から、サイトカインの分泌量を評価する指標を確立する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は電気回転計測の感度と分解能の評価に用いる標準的な電気特性を持つリポソームの作製法を確立した．電気形成法でリポソーム作製時にマンニトールの添加により内液に高い導電率を持つリポソームの作製に成功した．また，リポソームの電気形成に用いる電極基板上への微細な凹凸構造の形成によって，凸領域から選択的にリポソームをその場に保持した状態で作製できることを見出した．これは，リポソーム内での化学反応の経時変化の解析に利用できる新規なリポソーム形成法である．また，リポソームを構成するリン脂質（アニオン性，中性）の種類やコレステロール含有量によって誘電泳動挙動が異なることを見出した．アニオン性リン脂質の割合の増加によって正の誘電泳動と負の誘電泳動が切り替わる交差周波数が低周波数側へシフトした．これはアニオン性リン脂質の増加によって膜容量の増加を意味する．今後は別の膜容量評価法（交流電場下でのリポソームの変形度）でリポソームの膜容量を評価し脂質構成成分と膜容量の関連を明らかにする．そして膜容量が明らかになったリポソームの電気回転挙動を評価し，電気回転計測の精度を確定する．
また，リポソームにはサイズにばらつきがあるため、リポソームのサイズを選別する方法を確立した。細胞サイズのリポソームの交差周波数は400 kHzでありそれ以上高周波数の交流電圧の印加により正の誘電泳動の作用を見出した．一方で細胞サイズより小さなリポソームはより高周波数側に交差周波数が観察された．そのため400 kHz以下の交流電圧の印加により細胞サイズのリポソームの濃縮を見出した．今後は細胞サイズのリポソームを濃縮し細胞サイズのリポソームの電気回転評価を進める．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度の実施目標は，細胞の電気特性を示す標準粒子としてのリポソームの作製とその電気回転評価法の確立である．その結果，リポソームの電気形成時にマンニトールの添加によって細胞質と同程度の導電率を持つリポソームの調製に成功した．また，リポソームを構成するリン脂質の組成によって誘電泳動挙動が異なることを見出し，アニオン性リン脂質の含有率の変更により細胞膜容量の異なるリポソームを作製できることを明らかにした．さらにリポソーム懸濁液に400 khz以下の交流電圧の印加によって細胞サイズのリポソーム（直径8～15μm）に正の誘電泳動が作用し電極へひきつけられることを見出した．この特性の利用によって電極が配置したマイクロウエル型電気回転デバイスに細胞サイズのリポソームのみを選択的に捕捉できることを明らかにした．
以上より，細胞の電気的標準モデルであるリポソームの調製法を確立できたため計画通りの進捗と判断した．今後はリポソームを構成するリン脂質を変更し細胞膜容量の異なる種々のリポソームを調製し，細胞サイズのリポソームをマイクロウエル型電気回転デバイスに捕捉し，細胞膜容量と電気回転速度の関連を明らかにする．
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| Strategy for Future Research Activity |
以下の２点を明らかにする．
・電気特性の標準モデルであるリポソームの電気回転評価．
電気回転計測の精度の確立のために，リン脂質の構成割合を変更して種々の細胞膜容量を持つリポソームの電気回転計測を行う．電気回転速度と細胞膜容量の関係を明らかにして，電気回転計測の精度を検証する
・「フタ」つきウエル型電気回転デバイスの確立
単一細胞から分泌されるサイトカインを捕捉するための蓋をウエル型電気回転デバイスに配置する．細胞の電気回転計測を実施するとともに，各単一細胞から分泌されたサイトカインを蓋上に捕捉する．蓋上に捕捉されたサイトカイン量と電気回転速度の関連を明らかにして，電気回転計測からサイトカインの分泌活性の高いT細胞の識別を実現する．
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