Molecular dissection of a rhizobial effector dependent novel symbiotic pathway in legume-rhizobia symbiosis

• Project/Area Number: 23K26804
• Project/Area Number (Other): 23H02111 (2023)
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund (2024); Single-year Grants (2023)
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 38010:Plant nutrition and soil science-related
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture and Technology
• Principal Investigator: 岡崎 伸 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (40379285)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田淵 光昭 香川大学, 農学部, 教授 (00294637) ; 佐藤 修正 東北大学, 生命科学研究科, 教授 (70370921) ; 下田 宜司 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 上級研究員 (80415455)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2027-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥18,590,000 (Direct Cost: ¥14,300,000、Indirect Cost: ¥4,290,000); Fiscal Year 2026: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000); Fiscal Year 2025: ¥4,940,000 (Direct Cost: ¥3,800,000、Indirect Cost: ¥1,140,000); Fiscal Year 2024: ¥4,940,000 (Direct Cost: ¥3,800,000、Indirect Cost: ¥1,140,000); Fiscal Year 2023: ¥5,720,000 (Direct Cost: ¥4,400,000、Indirect Cost: ¥1,320,000)
• Keywords: 根粒菌 / エフェクター / 共生 / ダイズ / ３型分泌系 / III型分泌系

Outline of Research at the Start

病原細菌の中には、3型分泌系と呼ばれる細胞膜上の複合体により、宿主細胞に病原因子(エフェクター)を注入するものが存在する。申請者らは、マメ科植物と共生する根粒菌がエフェクターを利用して根粒形成するという、新しい共生経路を発見した。本研究では、世界各地の根粒菌における根粒形成エフェクターの同定、マメ科植物のエフェクター標的因子の探索、根粒菌エフェクターと宿主標的因子との分子相互作用の解析、および根粒菌エフェクターが誘導する共生シグナル伝達の解析を行うことで、根粒菌エフェクターによる新規共生経路の分子基盤の解明を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

1. 世界各地の根粒菌における根粒形成エフェクターの同定・・・根粒形成を誘導するエフェクターを探索するため、日本および世界各地の根粒菌をNFR の機能が欠損したダイズ （nfr 変異体）に接種し、根粒形成するものを探索した。その結果、新たに日本のダイズ根粒菌１株がnfr 変異体ダイズに根粒を形成することを見出した。既知の根粒菌エフェクターBel2-5のプライマーを用いたPCRでは増幅が確認できなかったため、この根粒菌株はBel2-5とは異なるエフェクターを保持する可能性が示唆された。今後全ゲノム配列を解析し、エフェクター遺伝子の情報を調査する予定である。
2. マメ科植物のエフェクター標的因子の探索（Pull down法）・・・大腸菌で発現させたBel2-5タンパク質とダイズ根のタンパク質を混合してインキュベーションし、相互作用するタンパク質をPull down法にて探索した。その結果、既知の根粒形成因子を含む複数のダイズ核タンパク質が相互作用候補として検出された。今後これらの候補タンパク質とBel2-5との相互作用を詳細に解析する計画である。
3. マメ科植物のエフェクター標的因子の探索（Yeast two hybrid法）・・・Yeast two hybrid法によるBel2-5相互作用タンパク質を①ダイズcDNA、および②酵母cDNAライブラリーでスクリーニングした。その結果、ダイズ、酵母、いずれのcDNAラブラリーからもユビキチン関連遺伝子が相互作用候補として検出された。酵母cDNAからはさらにSUMO（Small Ubiquitin-like Modifier）が検出された。これらの結果から、Bel2-5は構造から予測される脱SUMO活性だけでなく、ユビキチン化／脱ユビキチン活性も有する可能性が示唆された。今後、Pull down法等で相互作用の確認を行う計画である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

nfr変異体ダイズに根粒を形成する根粒菌を新たに１株発見することができた。PCR法ではこの２株はBel2-5を保持していないことが示唆されており、新規エフェクターを保持している可能性もある。今後全ゲノム配列を解析し、エフェクター候補遺伝子の抽出と機能解析により、新規根粒形成エフェクターの発見にいたる可能性も高いことから、順調に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

今回あたらしく発見したnfr変異ダイズに根粒形成可能な根粒菌株については、ゲノム解析を行い、情報学的解析によりエフェクター候補遺伝子の検出を行う。検出されたエフェクター候補遺伝子については、順次遺伝子破壊株を作成し、nfr変異ダイズに接種することで根粒形成エフェクターであることを証明する。
また、これまでPull down法およびYeast two hybrid法で得られた根粒菌エフェクターと相互作用する宿主標的因子の候補については、1対1のYeast two hybrid法や、Pull down法、BiFC法により相互作用を確認する。
さらに、エフェクターによる宿主標的因子の修飾や分解を出芽酵母発現系や大腸菌発現タンパク質を用いて解析する。特にエフェクターBel2-5には脱SUMO化活性を持つと予測されるULPドメインがあり、宿主標的タンパク質を脱SUMO化することで、標的タンパク質の活性や局在、他タンパク質との相互作用を制御している可能性が考えられるため、出芽酵母発現系や大腸菌発現タンパク質を用いてBel2-5の脱SUMO化活性の検出を試みる。

Research Products

• [Int'l Joint Research] フランス農業開発研究国際協力センター(フランス)
• [Journal Article] Widespread <i>Bradyrhizobium</i> distribution of diverse Type III effectors that trigger legume nodulation in the absence of Nod factor (2023)
  • Author(s): Camuel, A., Teulet, A., Carcagno, M. Haq, F., Pacquit, V., Gully, D., Pervent, M., Chaintreuil, C., Fardoux, J., Horta-Araujo, N., Okazaki, S., Ratu, S., Gueye, F., Zilli, J., Nouwen, N., Arrighi, J.F., Luo, H., Mergaert, P., Deslandes, L., Giraud, E.
  • Journal Title: The ISME Journal Volume: 17 Issue: 9 Pages: 1416-1429
  • DOI: 10.1038/s41396-023-01458-1
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] Symbiotic roles of rhizobial type III effectors (2024)
  • Author(s): OKAZAKI SHIN
  • Organizer: The 6th Asian-Pacific Conference on Plant-Microbe Symbiosis and Nitrogen Fixation
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Unveiling a novel paradigm in Bradyrhizobium strains triggering NF- independent nodulation in soybean (2024)
  • Author(s): Safirah Tasa Nerves Ratu, Shogo Fukunaga, and Shin Okazaki
  • Organizer: The 6th Asian-Pacific Conference on Plant-Microbe Symbiosis and Nitrogen Fixation
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Nod-factor independent symbiotic phenomena and symbiotic inhibition factor of Bradyrhizobium and Aeschynomene genus (2024)
  • Author(s): Shogo Fukunaga, Shun Hashimoto, Shusei Sato, Shin Okazaki
  • Organizer: The 6th Asian-Pacific Conference on Plant-Microbe Symbiosis and Nitrogen Fixation
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Type three secretion system (T3SS) of Bradyrhizobium elkanii USDA61 restricts nitrogen-fixation efficiency in Lupinus spp. (2023)
  • Author(s): Safirah Tasa Nerves Ratu, Lidia Amelia, Shin Okazaki
  • Organizer: The 36th Conference of the Japan Society for Microbial Ecology and the 13th Asian Symposium on Microbial Ecology
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Nod-factor independent symbiotic phenomena and symbiotic inhibition factor of Bradyrhizobium and Aeschynomene genus (2023)
  • Author(s): Shogo Fukunaga, Shun Hashimoto, Shusei Sato, Shin Okazaki
  • Organizer: The 36th Conference of the Japan Society for Microbial Ecology and the 13th Asian Symposium on Microbial Ecology
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] 東京農工大学 大学院農学研究院 国際環境農学部門 植物微生物研究室
  • URL: https://www.plant-microbiology.jp