| Project/Area Number |
23K26910
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| Project/Area Number (Other) |
23H02217 (2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 39040:Plant protection science-related
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| Research Institution | Setsunan University |
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Principal Investigator |
田中 茂幸 摂南大学, 農学部, 准教授 (30785481)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹下 典男 筑波大学, 生命環境系, 准教授 (20745038)
芳本 玲 摂南大学, 農学部, 准教授 (70595652)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥18,460,000 (Direct Cost: ¥14,200,000、Indirect Cost: ¥4,260,000)
Fiscal Year 2026: ¥5,330,000 (Direct Cost: ¥4,100,000、Indirect Cost: ¥1,230,000)
Fiscal Year 2025: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
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| Keywords | 細胞外小胞 / エクソソーム / 超解像顕微鏡 / 植物病原菌 / lincRNA / トウモロコシ黒穂病菌 / 長鎖ノンコーディングRNA |
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| Outline of Research at the Start |
植物病原糸状菌は分泌タンパク質などを用いて植物への感染を確立するが、高分子であるタンパク質が植物細胞膜をどのように通過するかはよくわかっていない。本研究では、トウモロコシ黒穂病菌を材料に、菌が分泌する細胞外小胞を介してタンパク質などの物質輸送が行われるという仮説の検証を試みている。特に、細胞外小胞膜上のタンパク質と相互作用する植物分子を同定することで、小胞膜と植物細胞膜の融合機構を明らかにしたい。また、タンパク質以外の病原性関連分子の同定や、超解像顕微鏡による小胞の動態観察を行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物病原糸状菌は、感染時にエフェクタータンパク質とよばれる分子を分泌する。これが植物細胞内で機能することで植物細胞の機能変化を引き起こし、糸状菌の感染を促進する。特に、生きた植物細胞に感染する活物寄生を行う糸状菌は、植物細胞膜を破壊しないため、侵入した菌糸は植物細胞膜に包まれている。これまで、このような関係において、なぜエフェクタータンパク質が植物細胞膜を通過し細胞内へ移行できるかは不明であった。本研究では、トウモロコシに感染する活物寄生性の糸状菌であるトウモロコシ黒穂病菌を実験材料にして、本菌が分泌する細胞外小胞に着目した研究を行う。細胞外小胞にはエフェクタータンパク質や機能未知長鎖ノンコーディングRNA（lncRNAs）が含まれ、また植物細胞膜との膜融合を介して内容物を細胞内へ送り込んでいる可能性が示唆されている。さらに、細胞外小胞上のインテグリン様膜タンパク質ILP1が、この膜融合を媒介することが示唆されている。そこで、2024年度では、①このILP1と相互作用する植物タンパク質の同定、②病原性に寄与するlncRNAの機能解析、③超解像顕微鏡による細胞外小胞の動態観察用の形質転換体構築を試みた。結果として、①については、プロテオーム解析および酵母ツーハイブリッド法を用いたスクリーニングにより、ILP1と相互作用する植物タンパク質候補として、PLATドメインを持つ分泌植物タンパク質が得られた。②については、2023年度に同定した病原性lncRNA2種のうち1種について、これに結合する植物タンパク質を同定した。③については、ILP1-paGFPを発現する形質転換体を作出し、タンパク質発現の確認を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2024年度では、①ILP1と相互作用する植物タンパク質の同定、②病原性に寄与するlncRNAの機能解析、③超解像顕微鏡による細胞外小胞の動態観察用の形質転換体構築を試みた。①については、プロテオーム解析および酵母ツーハイブリッド法を用いたスクリーニングにより、ILP1と相互作用する植物タンパク質候補として、PLATドメインを持つ分泌植物タンパク質が得られた。PLATタンパク質は動植物に広く保存されており、細胞膜と相互作用する脂質結合タンパク質であることが示唆されている。動物の例では膜融合を促進することが示唆されており、ILP1がPLATタンパク質を利用して細胞外小胞-植物細胞膜融合を促進している可能性が考えられた。②については、2023年度に同定した病原性lncRNA2種のうち1種について、プロテオーム解析および組み換えタンパク質を用いたin vitro実験により、これに結合する植物タンパク質LSm4を同定した。LSm4はスプライシング制御に関わる因子である。トウモロコシ黒穂病菌の野生株とlncRNA欠損株間で選択的スプライシング解析を行うと、植物免疫関連遺伝子群のエキソンスキッピングなどが起きていることがわかった。③については、mEosFPのかわりにpaGFPを超解像顕微鏡用のタグとして利用することにし、ILP1-paGFPを発現する形質転換体を作出した。また、これら形質転換体がILP1-paGFP融合タンパク質を完全長で発現していることをウェスタンブロットで確認した。以上より、2024年度では次年度での発展が期待できる成果が得られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
2024年度では、①プロテオーム解析および酵母ツーハイブリッド法を用いたスクリーニングにより、ILP1と相互作用する植物タンパク質候補として、PLATドメインを持つ分泌植物タンパク質を得た。②病原性lncRNAについて、プロテオーム解析および組み換えタンパク質を用いたin vitro実験により、これに結合する植物タンパク質LSm4を同定。③超解像顕微鏡用のILP1-paGFP発現株の作出、という成果を得た。これらの成果をもとに、2025年度は次の通り研究を進める。
①については、ILP1とPLATドメインタンパク質のin vivoでの相互作用を検証する。ベンサミアーナタバコでAgroinfiltrationによる一過的発現実験により、共免疫沈降やBiFCを行う。またPLATタンパク質の機能を明らかにするため、組み換えタンパク質を用いた脂質結合実験を考えている。②lncRNAとLSｍ4タンパク質のin vivoでの結合を確かめるため、同様にベンサミアーナタバコでの一過的発現を行う。この実験系において、lncRNAやLSm4タンパク質の細胞内局在を観察する。③については、形質転換体を用いて超解像顕微鏡を行い、細胞外小胞の動態を調べる。特に、細胞外小胞が菌糸細胞のどの部位から分泌されるのかに注視したい。
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