| Project/Area Number |
23K26940
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| Project/Area Number (Other) |
23H02247 (2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 40010:Forest science-related
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
山岡 裕一 筑波大学, 生命環境系, 名誉教授 (00220236)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
玉井 裕 北海道大学, 農学研究院, 教授 (50281796)
岡根 泉 筑波大学, 生命環境系, 准教授 (60260171)
石賀 康博 筑波大学, 生命環境系, 助教 (50730256)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥18,720,000 (Direct Cost: ¥14,400,000、Indirect Cost: ¥4,320,000)
Fiscal Year 2025: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2024: ¥5,200,000 (Direct Cost: ¥4,000,000、Indirect Cost: ¥1,200,000)
Fiscal Year 2023: ¥8,840,000 (Direct Cost: ¥6,800,000、Indirect Cost: ¥2,040,000)
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| Keywords | 植物病理学 / 樹病学 / 葉圏菌類 / 拮抗微生物 / 植物寄生菌 / 内生菌 |
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| Outline of Research at the Start |
北海道では、Ash diebackの病原菌Hymenoscyphus fraxineusが広く分布し、大量の感染源が存在する環境でありながら、本来本菌に感受性であるはずのセイヨウトネリコの植栽木が複数本生存している。その原因として、無発病のセイヨウトネリコに生息する葉圏菌類の拮抗作用が本菌の生長を抑制していると考えられた。そこで本研究では、拮抗性葉圏菌類をAsh diebackの防除や被害拡大の抑制に活用するための基盤研究として、拮抗性葉圏菌類の拮抗作用メカニズムおよび拮抗性葉圏菌類の生態の解明、ならびに拮抗性葉圏菌類のトネリコ類や他の植物に対する影響を評価することを目的とした。
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| Outline of Annual Research Achievements |
1）拮抗性葉圏菌類の拮抗作用メカニズムの解明：Aureobasidium pullulans（菌株No. 5029）の細胞懸濁液をセイヨウトネリコ生葉に接種2から21日後にHymenoschyphus fraxineus子嚢胞子を接種し、子嚢胞子の発芽率を測定した。その結果、接種5日後までは子嚢胞子の発芽が抑制されたが、接種7日後以降は発芽抑制効果は認められなかった。Colletotrichum fioriniae（菌株No. 7148）については、分生子懸濁液を塗布接種2日後と7日後にH. fraxineus子嚢胞子を接種した結果、顕著な発芽抑制効果が認められた。また、C. fioriniaeは接種5週後まで接種葉内で生存していること、分生子を接種したセイヨウトネリコ苗では非接種苗に比べ、H. fraxineus子嚢胞子接種3週後に、種特異的プライマーセットによるH. fraxineus DNA検出頻度が顕著に低下した。
エチレン、アブシジン酸、ジベレリン処理による病徴進展促進効果を検討したが、切り葉を用いてアブシジン酸処理した場合にH. fraxineus子嚢胞子の侵入率が僅かに上昇したが、顕著な効果は得られなかった。
2）拮抗性葉圏菌類の生態の解明：北海道大学北方生物圏フィールド科学センター札幌研究林（札幌研究林）に植栽され、枝枯れ等の症状のないセイヨウトネリコの成樹下で下種更新している実生の葉、茎および根系からPCRによりrDNA ITS2領域を増幅し、アンプリコンシーケンス解析を行った。その結果、Cladosporium sphaerospermumが高頻度で検出された．
3）拮抗性葉圏菌類のトネリコ類やその他の植物に対する影響評価：これまでに、A. pullulans、C. fioriniaeの接種により、セイヨウトネリコ上で顕著な病徴は認められていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Aureobasidium pullulansのH. fraxineus子嚢胞子発芽阻害効果が、生葉上での生存が確認された5週間は継続することを期待していたが、残念ながら効果は接種後数日までであり、予定していた拮抗作用メカニズムの解明には進めなかった。一方、C. fioriniaeについてはH. fraxineus子嚢胞子の発芽、感染・定着の抑制効果を確認することができ、本年度拮抗作用メカニズムの解明に進む予定である。
葉組織内でのH. fraxineusと拮抗性菌類の挙動を観察するため、生葉の老化促進を試みた。切り葉を利用した場合に H. fraxineusの感染率が僅かに上昇することが分かったが、病徴の再現には至らなかった。しかし、子嚢胞子感染から感染初期の観察には使用可能と考えられるため、引き続き検討を重ねる。
下種更新している実生の葉、茎および根系からは、これまでにトネリコ類成樹の小葉・葉柄から検出された拮抗性菌類がより高頻度で検出されることを期待していたが、殆ど検出されず、感染源が他の植物上である可能性が高まった。また、実生からは代わりにCl. sphaerospermumが高頻度で検出された。この菌が、セイヨウトネリコ実生の生存に影響を与えている可能性も有るため、あらたに検討を進める必要が生じた。
以上のように、予定よりも遅れている点も有るが、一方で新たな研究シードの発見もあり、総合的にはほぼ順調に進んでいると評価している。
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| Strategy for Future Research Activity |
1）拮抗性葉圏菌類の拮抗作用メカニズムの解明： C. fioriniaeの感染後のセイヨウトネリコ内での挙動と、H. fraxineusに対する抑制効果の持続性を明らかにする。H. fraxineus子嚢胞子の発芽、感染、感染組織内での菌糸成長抑制効果のメカニズム解明のため、C. fioriniaeまたはA. pullulansの感染により何らかの抗菌物質が蓄積されていないか検定するとともに、これらの拮抗性菌類の感染により宿主の抵抗性が誘導されていないか調べる。
また、セイヨウトネリコの下種更新苗からCl. sphaerospermumを分離し、H. fraxineusに対する拮抗作用の有無を人工培地上で検定する。拮抗作用が確認された場合には、セイヨウトネリコ生葉へ接種しその挙動とH. fraxineus子嚢胞子の発芽抑制効果を検定する。
2）拮抗性葉圏菌類の生態の解明：トネリコ類成樹から分離された拮抗性葉圏菌類が、生存するセイヨウトネリコ周辺の他種の植物上に定着していると仮定し、周辺植物（バラ科、マツ科の樹種など）の葉、茎等からDNAを抽出し、次世代シーケンサーを用いた葉圏菌類の網羅的な検出、ならびにA. pullulans、C. fioriniaeに絞って種特異的プライマーセットを用いた検出を行う。
3）拮抗性葉圏菌類のトネリコ類やその他の植物に対する影響評価：これまでのところ、A. pullulans、C. fioriniaeの接種により、セイヨウトネリコ上で顕著な病徴は認められていないが、C. fioriniaeの分生子が発芽して侵入した細胞では褐変が見られることがあり、褐変の範囲が拡大し壊死病斑とならないか組織学的観察を行い確認する。また、セイヨウトネリコ以外の外国産トネリコ類、ナナカマドなどのバラ科植物の苗に接種し、発病の有無を確認する。
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