| Project/Area Number |
23K26956
|
|---|
| Project/Area Number (Other) |
23H02263 (2023)
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
|
| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2023) |
|---|
| Section | 一般 |
|---|
| Review Section |
Basic Section 40010:Forest science-related
|
|---|
| Research Institution | Forest Research and Management Organization |
|---|
Principal Investigator |
上野 真義 国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所, 主任研究員 等 (40414479)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
丸山 毅 国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所, 研究専門員 (20353865)
西口 満 国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所, 主任研究員 等 (80353796)
鶴田 燃海 国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所, 主任研究員 等 (90809740)
森口 喜成 新潟大学, 自然科学系, 准教授 (60644804)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2027-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
|
| Budget Amount *help |
¥18,590,000 (Direct Cost: ¥14,300,000、Indirect Cost: ¥4,290,000)
Fiscal Year 2026: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2025: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2024: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,940,000 (Direct Cost: ¥3,800,000、Indirect Cost: ¥1,140,000)
|
|---|
| Keywords | スギ / 雄性不稔 / ゲノム編集 / 簡易DNA抽出 / CRISPR/Cas9 / Cryptomeria japonica / マーカー選抜 / 稔性回復 / 環境応答 / 遺伝子発現 / 花粉稔性 / 雄性不稔スギ |
|---|
| Outline of Research at the Start |
正常な花粉ができない雄性不稔のスギは、無花粉スギとして花粉症対策に活用されています。メンデルの遺伝法則に従うたった一つの遺伝子の異常によって、正常か不稔かというスギの花粉の稔性が質的に変化することが明らかになっています。その一方で、雄性不稔であっても、環境条件により稔性が回復し正常な花粉を生産する原因遺伝子がスギに存在する可能性があります。本研究では（１）環境感応性の雄性不稔の原因となる遺伝子を新たに特定して、その機能をゲノム編集により証明し、（２）稔性が回復する環境条件と生理生態の変化を遺伝子の発現解析により解明します。
|
| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、スギのMS2候補遺伝子の機能証明を目的に、MS２候補遺伝子を壊したゲノム編集スギの作成について前年度から引き続き取り組んだ。まずMS2遺伝子の異なる部位を標的とする遺伝子組換え用ベクター（前年度に作成）を、アグロバクテリウム法でスギの不定胚形成細胞に導入した。カナマイシンを含む培地で不定胚形成細胞を培養し、増殖する細胞を選抜した。これらの細胞からDNA粗抽出液を調製し、PCR法でカナマイシン耐性遺伝子の有無を確認したところ、約84%（27/32系統）の細胞がカナマイシン耐性遺伝子を持ち、遺伝子組換えが起こっていることを確認した。次に、遺伝子組換え細胞でMS2遺伝子に変異が起こっているかどうかを確認するため、PCR法でMS2遺伝子のDNAを増幅し、その塩基配列を決定した。その結果、MS2遺伝子に変異が生じていると推定される細胞が３系統、存在した。さらに遺伝子組換え細胞の作出およびMS2変異細胞の選抜を続けたところ、最終的に10系統のMS2変異細胞を得た。これらの細胞を不定胚形成培地で培養し、不定胚分化を誘導した。不定胚を発芽培地に移植して発芽・発根させ、遺伝子組換えスギを作出した。
またMS2のマーカー選抜の効率向上を図るために、従来のCTAB法に代わる簡易DNA抽出法を開発した。本法では針葉組織を洗剤・NaCl・PVP含有バッファーで室温にてホモジナイズし、ミニ遠心機（6,200rpm）で細胞残渣を除去後、エタノール沈殿とTE溶解を行う。本法は有害薬品を用いず、廉価な装置のみでPCR解析に十分なDNAが得られるため、現場でのマーカー選抜に有用である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CRISPR/Cas9ベクターをアグロバクテリウム法で不定胚形成細胞に導入し高効率な形質転換を実現し、最終的に10系統のMS2遺伝子のゲノム編集細胞を得ることができたため、機能証明のプロセスとして順調に進展していると考えている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
・選抜した変異細胞は、MS2遺伝子に変異がある細胞と変異が無い細胞が混在していると考えられるため、作出した遺伝子組換えスギのMS2遺伝子の変異を確認する。
・遺伝子組換えスギの育成を行いながら、各個体のMS2遺伝子のDNAの塩基配列を調べる。
・欠失や挿入など遺伝子の変異の種類を明らかにし、MS2対立遺伝子が破壊されたゲノム編集スギを選抜する。
・挿し木苗を用いて異なる環境条件下でMS2による雄性不稔スギを成長させ、各個体から採取した花粉を光学顕微鏡観察により観察し、生理生態学的知見を収集する。
|
