日本沿岸海域の時系列環境DNAデータベースに基づく魚類生態の解明

• Project/Area Number: 23K26980
• Project/Area Number (Other): 23H02287 (2023)
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund (2024); Single-year Grants (2023)
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 40030:Aquatic bioproduction science-related
• Research Institution: Kitasato University (2024); The University of Tokyo (2023)
• Principal Investigator: 吉武 和敏 北里大学, 海洋生命科学部, 講師 (50646552)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 星野 浩一 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 本部, 室長 (10649809) ; 後藤 亮 千葉県立中央博物館, その他部局等, 研究員 (10769897) ; 宮 正樹 千葉県立中央博物館, その他部局等, 主任上席研究員 (30250137) ; 北島 聡 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 水産資源研究所(横浜), 主任研究員 (50568045) ; 田所 和明 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 水産資源研究所(塩釜), 主幹研究員 (70399575) ; 長井 敏 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 水産技術研究所(長崎), 主幹研究員 (80371962) ; 渡辺 剛 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 水産資源研究所(釧路), 主任研究員 (80895920) ; 黒川 忠英 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 水産資源研究所(釧路), 研究員(再雇用) (50372032)
• Project Period (FY): 2024-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥18,720,000 (Direct Cost: ¥14,400,000、Indirect Cost: ¥4,320,000); Fiscal Year 2025: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000); Fiscal Year 2024: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000); Fiscal Year 2023: ¥6,760,000 (Direct Cost: ¥5,200,000、Indirect Cost: ¥1,560,000)
• Keywords: 環境DNA / HaCeD-Seq / D-loop / MiFish / MitoSearch / Mitosearch

Outline of Research at the Start

本研究では、まず第一に魚類の網羅的なeDNAデータベースであるMitoSearchを用い、在不在データに基づき、いつ、どこに、どのような魚がいるのかを把握し、魚類の時空間的な動態 (産卵生態や回遊生態) を解明する (第一の目的)。第二に、HaCeD-Seqを種横断的な手法に発展させ、二つの技術を融合することで日本沿岸性魚類の生態および資源量を把握する基盤技術の確立を目指す (第二の目的)。

Outline of Annual Research Achievements

- 神奈川県内でこれまでに環境DNAによる魚種組成調査が行われていなかった地点10か所から環境DNAを採集し、魚種組成を解明した。
- 水槽の水と比較すると、実際の海水では魚類eDNAの割合は低く、バクテリアの割合が高かったため、D-loopの検出が困難だった。そこで、魚類eDNAの割合を高める採取方法を模索したところ、フィルターを海に沈めるパッシブフィルタリングを行うことで魚類eDNAの割合を高めることが可能であった。
- D-loopのリファレンス配列の拡充としては、千葉県立中央博物館と水産研究・教育機構の所有している合計101個体の低カバレッジのショットガンシーケンスを行うことで、ミトコンドリア全長を決定することができた。
- ナノポアを使用した環境DNAのシーケンスの際に、インデックスホッピングが0.1%程度生じることが判明し、原因を究明してよりインデックスホッピングの生じないライブラリー調整手法を確立した。
- 魚類以外の生物群集の組成をeDNAから解明するため、種判定の際に広く用いられているミトコンドリア16S rRNA遺伝子のプライマーを使用してeDNA解析を行った。また、その解析に用いる16S rRNAのデータベースを作成し、解析フローをGitHubで公開した(https://github.com/mio49204920/eDNA/tree/main)。本解析フローを用いることで両生類、哺乳類、貝類といった生物種も検出可能であることを確認した(https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2025.04.09.643821v1)。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

2年目は実際の海水から個体数を推定する計画であったが、実際の海水では海水1Lあたりに含まれる細胞数が数個程度であり、海域全体の魚の個体数を推定するには数百L規模の採水を何度も行う必要があることが判明した。しかし、単純に採水量を増やしただけではバクテリアのDNAが多く、D-loopのPCRが困難であった。
そのほか、eDNA公共シーケンスデータの収集やD-loop参照配列用にミトコンドリア全長をシーケンスすることに関しては順調に進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

今年度、eDNA特異的な採取方法としてはパッシブサンプリング法が良いことが分かったため、来年度はパッシブサンプリング法のスケールアップを検証し、実際の海水での個体数推定を行いたい。