Highly pathogenic avian influenza infection can be overcome by natural immunity

• Project/Area Number: 23K27057
• Project/Area Number (Other): 23H02364 (2023)
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund (2024); Single-year Grants (2023)
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 42010:Animal production science-related
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 堀内 浩幸 広島大学, 統合生命科学研究科(生), 教授 (80243608)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2027-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥18,070,000 (Direct Cost: ¥13,900,000、Indirect Cost: ¥4,170,000); Fiscal Year 2026: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2025: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2024: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2023: ¥4,940,000 (Direct Cost: ¥3,800,000、Indirect Cost: ¥1,140,000)
• Keywords: 高病原性鳥インフルエンザ / 自然免疫 / ニワトリ / 宿主免疫応答 / ゲノム編集 / HPAIV / RIG-I / 抵抗性

Outline of Research at the Start

日本において，高病原性鳥インフルエンザウイルス(HPAIV)は，養鶏業界の脅威となっており2022年度は過去最大の被害となり，鶏卵生産にも 影響がでている。本研究では，我が国ではHPAIV対策に使用できない獲得免疫機構（ワクチネーション）に頼らない自然免疫系に着目し，HPAIV感受性ニワトリ，抵抗性ニワトリや遺伝子改変ニワトリをモデルとして利用し，HPAIV感染対策に有効な自然免疫系関連遺伝子の解析を行う。最終的には，HPAIVに感染しない，もしくは感染してもウイルスを排出しないニワトリの育種へ活用する。

Outline of Annual Research Achievements

・タイ在来鶏由来系統Xは，その交配系により9種（A~J）を導入し，孵卵胚から胚線維芽細胞（CEF）を培養した。培養したCEFは，poly(I:C)の導入と非導入系の2種に分け，それぞれからゲノムDNAとmRNAの抽出を行なった。抽出したmRNAは逆転転写によりcDNAを合成し，PCRに供試した。その結果，交配系AとEにおいて，ゲノムDNAおよびmRNAからアヒルRIG-Iと相同性を有する塩基配列が検出された。
・タイ在来鶏由来系統Xは，その交配系により9種から作出したCEFに対して，高病原性鳥インフルエンザ（HPAIV）分離株3種を感染させて細胞変性効果（CPE）とmRNAの抽出を行なった。CPEの観察では，感染24時間後から多くの細胞で細胞死に伴う培養器からの剥離が観察され，CPEの観察ができなかった。抽出したmRNAはcDNA合成まで終了させた。
・感染実験用に搬入したRIG-I強制発現トランスジェニックニワトリ では，輸送中に糞尿に血液が混入していることが観察され，腸管からの出血が想定された。一方，野生型のニワトリ では糞尿での血液の混入は認められなかった。
・感染依存的にRIG-Iを発現させるニワトリ の作出研究では，培養したニワトリ 始原生殖細胞（PGC）のMx遺伝子（マウスにおいてRNAウイルス感染時にRIG-Iと同様な発現パターンを示す）にCRIS-PITCh法を用いてMx遺伝子に共発現するようにRIG-Iをノックインした。ノックインしたPGCは，クローニング後，目的の位置にRIG-Iが導入されたものを選抜し，ニワトリの初期胚へ移植した。現在，移植胚から誕生した雛を育成中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2023年度に計画していたほぼ全ての研究計画を遂行することができた。
・タイ在来鶏由来系統Xは，その交配系の9種（A~J）の中にRIG-I相同遺伝子が存在する可能性が明らかになった。
・実際にHPAIVの感染実験をin vitroで行い，解析用試料を準備した。
・常時RIG-Iを発現しているRIG-I強制発現トランスジェニックニワトリは，輸送などのストレスに応答して粘膜組織等での炎症を起こすことが推定された。
・感染依存的にRIG-Iを発現させるニワトリ の作出研究は順調に進行している。

Strategy for Future Research Activity

・タイ在来鶏由来系統Xは，その交配系によりRIG-Iの相同遺伝子の存在が示唆された。2024年度は2023年度に検出されたRIG-I相同遺伝子のゲノム構成，転写翻訳系の有無，自然免疫に機能するかどうかを明らかにする。
・タイ在来鶏由来系統Xの交配系による遺伝的要因を9種（A~J）を用いて明らかにする。
・RIG-I強制発現トランスジェニックニワトリの腸管粘膜細胞に着目し，RIG-Iの常時発系における炎症の更新を解析する。
・感染依存的にRIG-Iを発現させるニワトリ の作出研究では，2024年度に10羽のG0世代からG1世代を作出し，RIG-I導入の有無まで確認する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] エディンバラ大学 ロスリン研究所(英国)
• [Journal Article] Chicken Interleukin-5 is Expressed in Splenic Lymphocytes and Affects Antigen-Specific Antibody Production (2024)
  • Author(s): Watanabe Tenkai、Terada Takumi、Ezaki Ryo、Matsuzaki Mei、Furusawa Syuichi、Horiuchi Hiroyuki
  • Journal Title: The Journal of Poultry Science Volume: 61 Issue: 0 Pages: n/a
  • DOI: 10.2141/jpsa.2024002
  • ISSN: 1346-7395, 1349-0486
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Wnt signaling blockade is essential for maintaining the pluripotency of chicken embryonic stem cells (2024)
  • Author(s): Ryota Kajihara, Ryo Ezaki, Kennosuke Ichikawa, Tenkai Watanabe, Takumi Terada, Mei Matsuzaki, Hiroyuki Horiuchi
  • Journal Title: Poultry Science Volume: 130 Issue: 2 Pages: 103361-103361
  • DOI: 10.1016/j.psj.2023.103361
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Lipofection with LipofectamineTM 2000 in a heparin‐free growth medium results in high transfection efficiency in chicken primordial germ cells (2023)
  • Author(s): Watanabe Tenkai、Ochi Yuta、Kajihara Ryota、Ichikawa Kennosuke、Ezaki Ryo、Matsuzaki Mei、Horiuchi Hiroyuki
  • Journal Title: Biotechnology Journal Volume: 18 Issue: 12
  • DOI: 10.1002/biot.202300328
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Evaluation of expression systems for recombinant protein production in chicken egg bioreactors (2023)
  • Author(s): Kajihara Ryota、Ezaki Ryo、Watanabe Tenkai、Ichikawa Kennosuke、Matsuzaki Mei、Horiuchi Hiroyuki
  • Journal Title: Biotechnology Journal Volume: 19 Issue: 1
  • DOI: 10.1002/biot.202300316
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Transcription activator-like effector nuclease-mediated deletion safely eliminates the major egg allergen ovomucoid in chickens (2023)
  • Author(s): Ezaki Ryo、Sakuma Tetsushi、Kodama Daisuke、Sasahara Ryou、Shiraogawa Taichi、Ichikawa Kennosuke、Matsuzaki Mei、Handa Akihiro、Yamamoto Takashi、Horiuchi Hiroyuki
  • Journal Title: Food and Chemical Toxicology Volume: 175 Pages: 113703-113703
  • DOI: 10.1016/j.fct.2023.113703
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] TranscriptionActivator-LikeEffectorNuclease-Mediated Deletion Safely Eliminates the Major Egg Allergen Ovomucoid in Chickens (2023)
  • Author(s): Ryo Ezaki, Tetsushi Sakuma, Daisuke Kodama, Ryou Sasahara, Taichi Shiraogawa, Kennosuke Ichikawa, Mei Matsuzaki, Akihiro Handa, Takashi Yamamoto, Hiroyuki Horiuchi
  • Organizer: Japanese Association for Animal Cell Technology 2023
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 家禽でのデジタル育種の構築に向けて (2023)
  • Author(s): 堀内浩幸
  • Organizer: 第46回日本分子生物学会年会
  • Invited
• [Presentation] Somatic Differentiation of Chicken Primordial Germ Cells Exhibits Partial Epithelial-to-Mesenchymal Transition (EMT)-like Features (2023)
  • Author(s): Kennosuke Ichikawa, Yuzuha Motoe, Mei Matsuzaki, Ryo Ezaki, Hiroyuki Horiuchi, Mike McGrew
  • Organizer: Japanese Association for Animal Cell Technology 2023
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Identification of feminization-related potential factors and processes in chicken primordial germ cells (2023)
  • Author(s): Kennosuke Ichikawa, Yoshiaki Nakamura, Hidemasa Bono, Ryo Ezaki, Mei Matsuzaki, Mike McGrew, Hiroyuki Horiuchi
  • Organizer: 11th Avian Model Systems Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ニワトリ始原生殖細胞への遺伝子導入とゲノム編集 (2023)
  • Author(s): 渡邊 天海, 池谷 亮, 江崎 僚, 寺田 拓実, 松崎 芽衣, 堀内 浩幸
  • Organizer: 第46回日本分子生物学会年会
• [Book] ゲノム編集の最新技術と医薬品・遺伝子治療・農業・水畜産物・有用物質生産への活用 (2023)
  • Author(s): 堀内浩幸，市川健之助
  • Total Pages: 605
  • Publisher: 情報技術協会
  • ISBN: 9784861049781
• [Remarks] 免疫生物学研究室
  • URL: https://immunobi.hiroshima-u.ac.jp/
• [Remarks] 鶏卵の主要なアレルギー原因物質をゲノム編集により除去し、その安全性を確認
  • URL: https://www.hiroshima-u.ac.jp/news/76416
• [Remarks] ニワトリ胚性幹(ES)細胞の維持に重要な細胞内伝達因子を特定
  • URL: https://www.hiroshima-u.ac.jp/news/81003
• [Remarks] ニワトリの精子や卵になる細胞への遺伝子導入を高効率化！～ゲノム編集ニワトリの作出効率を改善可能に～
  • URL: https://www.hiroshima-u.ac.jp/news/79054
• [Remarks] ゲノム編集技術により、ニワトリを利用した組換えタンパク質生産系を迅速に評価するモデルを構築
  • URL: https://www.hiroshima-u.ac.jp/news/80171
• [Patent(Industrial Property Rights)] オボムコイドを含まない殻付き鶏卵の選別方法 (2023)
  • Inventor(s): 山本広史，澤田真実，児玉大介，堀内浩幸，江崎僚
  • Industrial Property Rights Holder: 山本広史，澤田真実，児玉大介，堀内浩幸，江崎僚
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2023
  • Acquisition Date: 2023