| Project/Area Number |
23K27065
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| Project/Area Number (Other) |
23H02372 (2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 42020:Veterinary medical science-related
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
稲葉 睦 北海道大学, 獣医学研究院, 教授 (00183179)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
森下 啓太郎 北海道大学, 獣医学研究院, 准教授 (30637046)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥18,850,000 (Direct Cost: ¥14,500,000、Indirect Cost: ¥4,350,000)
Fiscal Year 2025: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2024: ¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000)
Fiscal Year 2023: ¥8,320,000 (Direct Cost: ¥6,400,000、Indirect Cost: ¥1,920,000)
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| Keywords | 赤血球 / 赤芽球造血 / 貧血 / コレステロール / 細胞内輸送 / コレステロール結合タンパク質 / コレステロール結合蛋白質 |
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| Outline of Research at the Start |
TSPO2は後期赤芽球に特異的に発現するコレステロール結合膜蛋白質である。TSPO2は細胞外から取り込んだコレステロールの細胞内動態を制御し、後期赤芽球の正常な増殖と成熟を支える。しかし、その分子機序は不明である。本研究では、TSPO2が細胞内のどこで、どのような分子機作で、小器官や細胞膜の間のコレステロール輸送を担い、コレステロール分布をどのように制御するのかをTSPO2遺伝子のノックアウトマウス／改変マウスの赤芽球や培養赤芽球細胞等を用いて解析し、TSPO2介在性コレステロール輸送の仕組みと意義を明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
TSPO2の細胞内分布・コレステロール分布との関係を主にマウスES細胞由来赤芽球系培養細胞(MEDEP)の正常(WT)細胞、Tspo2－/－細胞、ならびにTspo2－/－細胞にTSPO2-HAを導入した細胞(Tspo2－/－HA)を用いて調べた。
1）Tspo2－/－細胞は遊離コレステロールをを小胞体ERでエステル型（CEs）に変換し脂肪滴(LD)に貯蔵する割合が低く、多くは細胞外に失われること、TSPO2-HAの発現でこの異常は解消すること、高コレステロールマウス血清（主にHDL由来のCEsが高濃度）はWTと同程度のCEs蓄積を生じることを明らかにした。
2）MEDEP細胞にTSPO2-HAを導入・発現させると、Golgin、LAMP2、NPC1等との共在からゴルジ装置、リソソームに分布することが示された。同時にcalnexinやRab5, 7, 11等core Rabsとの近接から、各種エンドソーム、小胞体の近傍に位置することも示された。さらにclathrinやcatalaseとも近接した分布が観察された。Tspo2遺伝子をTspo2-HAに変換したMEDEP細胞でも同様の結果が得られた。TSPO2が主にゴルジやリソソームに分布し、小胞体をゴールとして、各種輸送小胞やペルオキシソーム、小胞体との間のコレステロール輸送に関与することが推定された。
3）MEDEP細胞や骨髄由来赤芽球では、TSPO2と細胞内コレステロール両者の分布の相互関連を明確に示すことは困難であった（解像度の不足、ならびに細胞質が狭く明確な分布をしめすことの困難による）。そこでTSPO2-EGFPを導入したHEK293細胞で同様の解析を実施し、それが細胞内遊離コレステロールの分布とほぼ一致することが判明したが、どの小器官が関わるかまでは見同定である。一方でCEsとは異なる分布が明らかであった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1．本年度の課題1の目的はTSPO2の赤芽球系細胞内分布、ならびに細胞内コレステロール分布との関係を明らかにすることである。細胞内分布については、ゴルジ装置、ライソゾームを含む複数の小器官に存在することは間違いなく、また細胞内輸送小胞への分布の可能性が示された。これはTSPO2が特定の限定された小器官ではなく複数の小器官膜に分布して、それらの間での物質転送に寄与する仮説に適合する。さらに、赤芽球系細胞での検証は困難であったが、TSPO2と細胞内コレステロールの分布にも相関が認められたことは、コレステロールがその小器官間転送の基質になり得ることを示唆している。これらからの本年度の目標への基本的な答を得ることはできた。
2．課題2は上記のような膜間転送の実証と機作の解明に向けた準備である。こちらは次年度以降に継続する課題であり、小器官膜の調製法の確立やTSPO2変異体の作製などを若干の遅れがあるものの開始している。
以上の状況から進捗状況として（2）概ね順調と判定した。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度計画の実施過程で、赤芽球系細胞／赤芽球系培養細胞の細胞内局在解析の困難さに直面した。予想されたことではあるが、コレステロールやTSPO2の分布は細胞内小器官マーカーを頼りに概要は推定できるが、細胞自体の小ささ、細胞質領域の狭さなどから厳密な結論は困難なのも確かである。そこで次年度以降では、HEK等の非赤芽球系培養細胞も活用し、概要を従来得たMEDEPや骨髄赤芽球での知見と比較しながら計画を進める。小器官膜の調製もこうした培養細胞にTSPO2等を発現させたうえで実施することが効果的と考える。
一方で、従来、マウス由来の赤芽球や培養細胞を用いている。今年度半ばから共同研究者として骨髄赤芽球細胞解析／貧血病態解析に詳しい森下啓太郎准教授が加わったので、臨床現場での臨床検体の活用／貧血病態に関連づけた解析を同時に進め、TSPO2機能・役割の普遍性検証につなげて計画全体の活性化に努める。
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