減数分裂の染色体の振る舞いを規定する2種類のコヒーシンの特性の解明

• Project/Area Number: 23K27085
• Project/Area Number (Other): 23H02392 (2023)
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Multi-year Fund (2024); Single-year Grants (2023)
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 42030:Animal life science-related
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 李 智博 神戸大学, 農学研究科, 准教授 (50372660)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2027-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥18,720,000 (Direct Cost: ¥14,400,000、Indirect Cost: ¥4,320,000); Fiscal Year 2026: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000); Fiscal Year 2025: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2024: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2023: ¥6,760,000 (Direct Cost: ¥5,200,000、Indirect Cost: ¥1,560,000)
• Keywords: 減数分裂 / コヒーシン / 相同染色体 / 対合 / 生殖細胞

Outline of Research at the Start

２種類の減数分裂特異的コヒーシンサブユニットRAD21LとREC8は相同染色体の結合を確立するために必須であるが，どのように両者が関わるかわかっていない。本研究では，これまでの遺伝学的解析とは一線を画し，RAD21L型コヒーシンとREC8型コヒーシンについて，共免疫沈降物の質量分析による相互作用分子の同定と同定したタンパク質の機能解析，電子顕微鏡による形状解析，in vitro DNA結合アッセイなど様々な角度から特性を解析し，両者が相同染色体の結合の確立にどのように寄与するかを明らかにする。

Outline of Annual Research Achievements

減数分裂は配偶子形成のための特殊な分裂であり，体細胞分裂とは染色体の分離様式が異なり，最初に相同染色体どうしが結合するが，どのように相同染色体がお互いを認識して結合するかよくわかっていない。本研究では減数分裂における相同染色体の結合の分子基盤を明らかにするために，相同染色体の対合と組換えに必須の２種類の減数分裂特異的コヒーシン（RAD21L型とREC8型）を様々な角度から解析し，それらの特徴を調べることを目的としている。
減数分裂のコヒーシンサブユニット間およびそれらと新規に相互作用する候補分子の直接的相互作用を調べるために，in vitro転写・翻訳キットによりそれらのタンパク質を合成し，免疫沈降法により共沈するかどうかを調べた。In vitroでのタンパク質の合成まではうまくいったが，免疫沈降法による相互作用の解析では，コヒーシンサブユニット間においても相互作用は検出されなかった。その原因として，in vitroで合成したタンパク質では相互作用に必要な立体構造がうまく取れていない可能性が考えられた。
Rad21L-3×Flag KIマウスとRec8-3×Flag KIマウスの精巣抽出液を用いて免疫沈降法により精製したコヒーシンを質量分析により調べた。その際に安定動態で標識したコヒーシンサブユニットを標準ペプチドとしてコヒーシンサブユニットの定量を試みたが，測定結果が安定しておらず，最適な標準ペプチドをまだ得られていない。
Rec8-3×Flag KIマウスの精巣抽出液から二段階の精製により，高純度のコヒーシン複合体を精製できるプロトコルを確立できたが，その過程でタンパク質の量が大幅に減少したため，その先の解析には進めていない。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

免疫沈降物の精製度をあげる過程で，実験器具へのタンパク質の吸着量が予想以上に大きく様々なプロトコルを試すのに手間取ったため。

Strategy for Future Research Activity

コヒーシンサブユニット間や他のタンパク質との相互作用の解析には，in vitro実験系に代わり，培養細胞での発現系を使うことにより，成体内のタンパク質の状態に近づける。また，質量分析による定量実験では，全サブユニットではなく，核となるサブユニットだけに解析の対象をしぼり，１タンパク質について標準ペプチドを多数準備することにより，最適な標準ペプチドを見つけられるようにする。高純度のコヒーシン複合体を精製する実験では，精製過程での実験器具へのタンパク質の吸着を無視できるぐらいに，実験開始時点での材料（精巣抽出液）を大幅に増やす。