| Project/Area Number |
23K27146
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| Project/Area Number (Other) |
23H02453 (2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43040:Biophysics-related
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
横山 謙 京都産業大学, 生命科学部, 教授 (70271377)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥18,720,000 (Direct Cost: ¥14,400,000、Indirect Cost: ¥4,320,000)
Fiscal Year 2025: ¥6,110,000 (Direct Cost: ¥4,700,000、Indirect Cost: ¥1,410,000)
Fiscal Year 2024: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2023: ¥6,110,000 (Direct Cost: ¥4,700,000、Indirect Cost: ¥1,410,000)
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| Keywords | ATP synthase / V-ATPase / 生体エネルギー変換 / Rotary molecular motor / CryoEM / 回転分子モーター / クライオ電子顕微鏡 / 単粒子解析 / bioenergetics / ATP合成酵素 / リポソーム |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では，プロトン駆動力でATP合成中のV型ATP合成酵素(V/A-ATPase)，および回転中のVo部分の構造を，クライオ電子顕微鏡により決定し，プロトン駆動力によるV/A-ATPaseのATP合成機構，およびVo部分の回転機構の分子基盤を解明する。そのため、V/A-ATPaseを，光駆動性のプロトンポンプであるバクテリオロドプシンとリポソームに共再構成し，光照射によりV/A-ATPaseリポソームにプロトン駆動力を負荷し，V/A-ATPaseにATPを合成させ，どのような構造変化がプロトン駆動力で誘起され、効率よく ATPが合成されるかを解明する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
膜タンパク質には，生体膜間の水素イオン（プロトン）の濃度勾配による電気化学的ポテンシャル差（プロトン駆動力, proton motive force, pmf）で機能するものが多数ある。応募研究の目的は，プロトン駆動力によりATP合成中のV/A-ATPase，および回転中のVo部分を，クライオEMで構造解析し，プロトン駆動力によるATP合成および回転力発生の分子基盤を解明することである。
V/A-ATPaseとbRの共再構成リポソーム作成の条件検討は完了しており，このリポソームの光照射による連続的なATP合成反応も確認している。本年度では，予備実験としてV/A-ATPaseとbRの共再構成リポソームに光を照射し、リポソームそのものの電顕画像を撮影した。得られたATP合成状態でのクライオEM画像1枚から平均で100-200のV/A-ATPase単粒子画像を抽出した。得られた約200万個のV/A-ATPaseの単粒子画像から，原子モデル構築が可能なV1 部分の3D構造を再構成した。pmf がない状態では、V1部分には ATPが確認できなかったが、pmfがある場合、ATPと思われる密度が、３つの触媒部位上に確認できた。このように、リポソーム上のV/A-ATPaseの高分解能構造解析が可能であることを確認できた
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
前述のように、pmf を付加した状態での V/A-ATPase の構造解析を実施し、ATPが酵素上で合成されていることも確認している。合成中の ATP合成酵素の構造スナップショットを得るという目的は達成された。ただし、撮影枚数の制限から分解能が十分でなく、V1部分でどのような構造変化があるのかは、さらに分解能を向上されたマップからモデルを構築し、pmf 存在下、非存在下のマップを比較する必要がある。また、Vo部分に関しては、現在構造解析を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
より高分解のマップを得るために、引き続き pmf 存在下での V/A-ATPase のクライオ電顕画像の撮影を進める。複数の中間体構造の存在が予想されるため、解析に必要な単粒数は数百万と考えている。必要とされるクライオ電顕画像は、画像の質にもよるが十万枚程度と見積もっており、数日間をかけて撮影する予定である。撮影と平行して単粒子画像解析を進める。特に、Vo部分の構造に焦点を当てた構造解析を行う。pmf によりどのような中間体構造が出現するかを解明し、pmf による連続的な構造変化過程を捉える。
さらに回転中の Voの構造を決定する。単離したVoには，疑似3回対称構造のV1部分が結合していないので，12回対称の回転リング (c12-ring)に対応した12の構造が，回転中のVoの構造からクラス分けされるはずである。回転中のVoから別の構造がクラス分けできれば，プロトン駆動力による回転を引き起こす構造変化をより詳細に議論できる。
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