Development of a method for targeted long-read methylation analysis and application to breast cancer specimens
| Project/Area Number |
23K27160
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| Project/Area Number (Other) |
23H02467 (2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43060:System genome science-related
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
関 真秀 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 特任准教授 (90749326)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
永澤 慧 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 特任研究員 (20773039)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥18,850,000 (Direct Cost: ¥14,500,000、Indirect Cost: ¥4,350,000)
Fiscal Year 2025: ¥5,460,000 (Direct Cost: ¥4,200,000、Indirect Cost: ¥1,260,000)
Fiscal Year 2024: ¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2023: ¥7,020,000 (Direct Cost: ¥5,400,000、Indirect Cost: ¥1,620,000)
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| Keywords | DNAメチル化 / 乳がん / エピジェネティクス / ナノポアシークエンサー |
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| Outline of Research at the Start |
長鎖シークエンサーを用いることで、従来の短鎖シークエンサーで解析できなかった領域や染色体ごとのDNAメチル化解析が可能である。しかし、少ない量のDNAから、メチル化が重要な役割を果たすDNA領域を、選択的に解析する方法は存在しなかった。そこで、以前に開発した長鎖DNAメチル化解析法nanoEM法と、選択的にDNA配列を取得することのできるハイブリッドキャプチャー法を組み合わせることで、領域選択的な長鎖DNAメチル化解析法を開発する。さらに、DNAメチル化が重要であることが知られている乳がんでの解析を行うことで、乳がんの発がんに関わるDNAメチル化の変化を解析する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
2023年度は、ターゲット領域特異的な長鎖DNAメチル化解析法t-nanoEMの開発を中心に実施した。ターゲットキャプチャーにおける試薬や温度などの条件を最適化することにより、収量や特異性を改善した。また、キャプチャーに使用するプローブについては、100 Mb以上の領域をカバーした大規模なものと1.5 Mbの小規模なものの２種類を検討した。いずれも高い特異性でターゲット領域由来のライブラリーが取得でき、特に、1.5 Mbのプローブについては、100倍以上の濃縮率でターゲット領域を解析できることを示した。インプットDNA量についても検討した結果、10 ngのゲノムDNAから実施できることを確認した。また、t-nanoEM法で取得したメチル化情報を他法で取得されたデータと比較し、正確にメチル化を検出可能であることを確認した。さらに、コスト削減やハイスループット化のために、ターゲットキャプチャー前に複数ライブラリーをプールする方法の開発も行い、その有効性を検証した。以上により、t-nanoEM法の確立と評価を行うことができた。さらに、乳がん検体１症例と空間発現データを取得済みの肺がん検体2症例について、t-nanoEM法を適用した。それぞれの凍結切片から、4-5領域程度をダイセクション・DNA抽出し、t-nanoEMデータを取得した。乳がん検体については、同一領域のショートリードのWGS、RNAseq、EMseqデータについても取得した。
開発したt-nanoEM法について、２つの学会（Seki & Suzuki. The 14th International Workshop on Advanced Genomics 2023; 関, 鈴木. 第46回日本分子生物学会年会 2023）において発表を行った。また、RNAseqについての知見を書籍で発表した（関, 鈴木. 羊土社）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本研究課題の主題であるt-nanoEMの開発まで完了することができ、予定通りに順調に進捗できていると考えられる。また、乳がん臨床検体の収集や、その解析についても予定通り進めることができている。乳がんに加えて、別のプロジェクトで空間解析データを取得済みの肺がん検体についてもデータ取得ができており、当初の計画以上に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度に開発を行ったt-nanoEM法について、取得されたデータの情報解析を進めて、投稿論文としてまとめる。また、乳がんを含む腫瘍サンプルの取得も継続して行う。今後のサンプル数を増やした解析に向けて、t-nanoEM法に使用してきたキャプチャープローブについてターゲット遺伝子の選択を行い、最適化を図る。最適化したプローブでがん検体のt-nanoEMによるメチル化解析を進める。さらに、メチル化による制御を明らかにするために、空間トランスクリプトーム解析や多重免疫染色解析についても行う。
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Report
(1 results)
Research Products
(3 results)
