| Project/Area Number |
23K27316
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| Project/Area Number (Other) |
23H02625 (2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 47020:Pharmaceutical analytical chemistry and physicochemistry-related
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| Research Institution | Teikyo University |
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Principal Investigator |
三枝 大輔 帝京大学, 薬学部, 准教授 (90545237)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
可野 邦行 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 助教 (50636404)
松本 洋太郎 東北大学, 薬学研究科, 講師 (90420041)
青木 順 大阪大学, 大学院生命機能研究科, 招へい教員 (90452424)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥18,720,000 (Direct Cost: ¥14,400,000、Indirect Cost: ¥4,320,000)
Fiscal Year 2025: ¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000)
Fiscal Year 2024: ¥5,850,000 (Direct Cost: ¥4,500,000、Indirect Cost: ¥1,350,000)
Fiscal Year 2023: ¥6,630,000 (Direct Cost: ¥5,100,000、Indirect Cost: ¥1,530,000)
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| Keywords | MSイメージング / S1P / MALDI / 脂質ラフト / 細胞外小胞 / スフィンゴ脂質 / 質量分析計 |
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| Outline of Research at the Start |
初めに、スフィンゴ脂質を細胞オルガネラレベルで検出できる MSイメージング法を開発する。検出された脂質分子種は、レーザーマイクロダイセクションとLC-MS/MSなどにより評価する。次に、脂質ラフトあるいはエクソソーム分泌過程で分布蓄積するスフィンゴ脂質を可視化する。エクソソームに含まれる脂質の評価には、LC-MS/MSを用いる。最終的には、病変部位に対し、開発したMSイメージング法を用いた脂質変動解析から創薬標的を明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
スフィンゴ脂質は、細胞膜形成あるいは脂質メディエーター機能により、生体の恒常性維持に必須の分子群であり、がんや免疫疾患発症に関連することが示唆されている。また、細胞膜に含まれる脂質ラフトや細胞外小胞のエクソソームの主要構成脂質でもあり、スフィンゴ脂質の代表分子であるスフィンゴシン一リン酸(S1P)を介したエクソソーム分泌機構が細胞間シグナル伝達に重要な役割を担うことが判っている。しかしながら、スフィンゴ脂質変動を細胞膜脂質ラフトレベルで直接観察することは困難であり、機能解析の障壁となっていた。そこで本研究の目的は、スフィンゴ脂質を細胞オルガネラレベルで検出できるMSイメージング法を開発し、脂質ラフトあるいはエクソソーム分泌過程で分布蓄積するスフィンゴ脂質を可視化し、病変部位での変動を捉えることで創薬標的を明らかにすることである。
MSイメージングによるオルガネラレベルでの可視化を実現するためには、各分析条件における更なる高感度化が必須である。R6年度は、主に①神経細胞培養サンプルのMSイメージング分析、②導電性粘着フィルムの高感度化、③Phostag誘導体化試薬の合成および④細胞外小胞検出条件の最適化に取り組んだ。特に、新規Phostag誘導体化試薬により、S1Pの検出感度が5倍程度向上し、大きな成果が得られた。R7は、開発した条件の再現性を評価し、全ての技術を組み合わせることにより、オルガネラレベルにおけるスフィンゴ脂質の可視化に挑戦する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
R6年度の進捗は以下の通りである。①MSイメージング分析は、投影型の高感度化に苦戦しているため、一般型のMSイメージング装置を用い、スライドガラス上で培養した神経細胞の分析に挑戦した。分析感度の面では不足しているが、神経細胞分布と一致するグリセロリン脂質の検出に成功した。現在、セラミドの分布データを取得すべく、培養サンプルの調整を実施している。R7年度は、投影型MSイメージングならびに一般型MSイメージングを用いて、細胞オルガネラに分布する数種の分子のイメージング画像を取得する予定である。
②オルガネラレベルの脂質を高感度に分析することが必要であるため、導電性粘着フィルムの改良を試みた。R5で高感度化に成功した導電性フィルムを用い、ゼブラフィッシュや植物など、複雑な切片作成に成功し、さらに微細構造の脂質分布を明らかにすることができた。
④新たに、Znを他金属元素に置き換えたPhostag誘導体化試薬を合成した。MALDI-MSによる分析を実施したところ、誘導体化されたS1P由来のスペクトルを確認することができた。R5で課題となったMnのPhostagのマトリックス結晶サイズが大きいことと比較し、新たに選択した金属元素X(特許出願のため非公開)のPhostagは結晶もZnのPhostagと同等であり、さらに5倍程度S1Pの高感度化に成功した。
⑤近年、細胞外小胞を解析した結果の妥当性を評価することを目的とし、細胞外小胞の量やサイズの解析データが必須項目となっている。そこで我々も、細胞外小胞に含まれる脂質分子種の分析結果の発表するために、形態解析を実施するプロトコルを作成した。具体的には、透過型電子顕微鏡による観察、ナノトラッキング解析によるサイズと量の計測、CD9とCD63を標的としたELIZA法によるタンパク定量を実施することとし、このプロトコルによって得られた脂質分子種の変化を正確に理解することが可能になった。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在までに、オルガネラレベルのスフィンゴ脂質分析技術開発に向けた各種条件検討にて一定の成果が得られている。R6の最も大きな課題であった、Phostag誘導体化試薬によるS1Pの高感度化については、金属元素Xを用いることにより、結晶サイズ感度、ともに一定の成果が得られたことから、特に大きく進捗した（特許出願計画中）。更なる高感度化を目指し、複数種の対イオン試薬を合成しており、R7はこの課題に取り組む。一方、機器の都合で遅れている投影型MSイメージングによるスフィンゴ脂質の可視化の実現に向けて、m/z 350以上のイオンの分析を安定してできることを目指す。また、R7は、投影型MSイメージング法で良好な成果が得られなかった場合を想定し、一般型MSイメージング分析によるオルガネラレベルのスフィンゴ脂質分析に挑戦する。特に課題となるのは、スライドガラス上での細胞培養であるが、この点はすでにいくつか条件検討を実施する予定であるため、セラミドなどの濃度が高い分子の検出は可能であると考える。最終的には、神経細胞のオルガネラレベルあるいは細胞培養液から採取した細胞外小胞に含まれるS1Pを含むスフィンゴ脂質の可視化に挑戦する。個体の組織切片レベルに向けた検証も準備しているが、装置開発についての妙案が必要であることから、国内外の研究者との情報収集に努める予定である。
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