| Project/Area Number |
23K27337
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| Project/Area Number (Other) |
23H02646 (2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 47060:Clinical pharmacy-related
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
楠原 洋之 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 教授 (00302612)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中村 和昭 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 薬剤治療研究部, 室長 (80392356)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥18,590,000 (Direct Cost: ¥14,300,000、Indirect Cost: ¥4,290,000)
Fiscal Year 2025: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000)
Fiscal Year 2024: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000)
Fiscal Year 2023: ¥6,630,000 (Direct Cost: ¥5,100,000、Indirect Cost: ¥1,530,000)
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| Keywords | 薬物動態 / ヒト由来細胞 / オーファントランスポーター / in vitroモデル / ヒト由来初代培養細胞 / トランスポーター / 薬物代謝 / 薬物輸送 / 初代培養細胞 / ヒト予測 / ADME / ヒトモデル |
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| Outline of Research at the Start |
非臨床段階で実施する薬物動態特性や薬物相互作用リスク、安全性予測は、新薬の開発の成否を決定する極めて重要な課題である。ヒトにおける予測性を高めるため、ヒト由来試料を用いたin vitroモデルを開発することを目的とする。培養時の添加物や細胞培養デバイスを利用することで、薬物動態ならびに安全性に資することができる優れたモデルを開発することに取り組む。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ヒト由来細胞を用いて、薬物の代謝やトランスポーター機能を定量的に評価可能なin vitro薬物動態特性や安全性評価モデルを開発することに取り組んている。遊離肝細胞はプレートへの低接着性が課題であったが、ヒト肝細胞表面細胞外マトリックスの種類と接着性との関連について明らかにし、新たに効率的に細胞外マトリックスを除去し肝細胞の接着性を向上させる条件を見出した。また、in vitro評価系において肝障害をより正確に評価するために、肝組織からクッパ―細胞、星細胞等の間比実質細胞を単離する方法を確立し、同一ドナーに由来する肝細胞とクッパ―細胞をin vitro評価系で使用できる環境を整えた。トランスポーター機能を発現するスフェロイド由来のヒト近位尿細管上皮細胞をフィルター上に播種し、薬物添加によりTEERの増加は認められたが、典型基質の経細胞輸送は対照群と同程度であった。有機カチオントランスポーターOCT2強制発現細胞を用いた解析から、OCT2を介した排出輸送も認められ、この輸送過程に対する阻害が薬物相互作用予測に影響を与えることを示唆する結果を得た。手術残余検体に加えて、市販のヒト凍結細胞から樹立した幹細胞を用いても、分化後の細胞を用いて薬物代謝や分泌を評価可能であることを確認した。EGFの添加によるTEERの向上とclaudin分子種の発現変動との関連、半気相培養の導入により細胞の厚みが増すなど新たな培養方法による知見を得た。オーファントランスポーターSLC35Fファミリー（SLC35F1）について、すでに候補化合物を同定し、細胞における輸送機能に対する変異体解析に取り組んでいる。N末欠損トランスポーターやC末のリン酸化部位に変異を導入した変異体の解析結果を得た。研究の引継に伴いトランスフェクション効率や播種密度を検討し、輸送実験のための最適化を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヒト肝細胞に関しては、細胞表面のECMを効率的に除去する方法を開発し、新たに肝組織からクッパ―細胞、星細胞等の間比実質細胞を単離する方法を確立し、より複雑なin vitroモデル構築にも着手した。同一ドナー由来の細胞で構成できる点は従来にない特徴であり、より精緻な肝毒性評価モデルとして医薬品開発への適用が期待される。当初の予定を超えて研究は進展している。腎近位尿細管上皮細胞に関しては、スフェロイド培養によりトランスポーター発現を獲得することは既報となったが、同細胞はフィルター上への播種後に単層培養に課題が認められる。当初、計画した薬物では寧ろTEERの減少と細胞間隙を介したリークが増加してしまったが、小腸細胞に対してTEERが増加した別の薬物群添加によりTEERの増加は認められた。膜透過性の低い薬物と高い薬物で細胞透過性の違いが認められており、多孔性フィルター上で単層膜の形成には至ったものと考えており、トランスポーターの発現を維持することの確認に進む段階と考え、概ね計画通りに進捗していると考えている。小腸細胞に関しては、市販されているヒト凍結小腸細胞を三次元培養することで樹立した幹細胞スフェロイドから分化させた吸収上皮細胞も薬物代謝・輸送能を維持していることが確認され、包括同意が取得されている細胞ソースとなる。また、生理活性ペプチドの添加によるclaudinたんぱく質の発現変動や、半気相培養による細胞厚みの増加など、ユニークな特性を見出している。オーファントランスポーターであるSLC35F1についてN末端配列の変異体およびC末端側の変異体作成を通じて、基質となる化合物の輸送に対する再現性も向上した。SLC35F2の基質選択性には種差が認められたことから、これを手がかりとしてSLC35F3以降のホモログについても、発現ベクターの準備が整っており、順調に進捗している。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒト肝細胞については引き続き、ECMとの相互作用に注目し、非実質細胞との共培養系での肝細胞機能の解析を実施し、当該モデルの医薬品開発における有用性を検証する。腎臓細胞については、薬物の添加に加えて、旋回培養等により剪断応力を細胞に負荷した状態での培養を試み、TEERに対する影響、ならびに既知の薬物輸送に与える影響を評価する。既知トランスポーター基質に加えて、遺伝子発現プロファイルに基づいて、基質と想定される薬物の分泌・再吸収方向の経細胞輸送を評価することで、腎近位尿細管分泌・再吸収の機能の再現を確認し、当該モデルの医薬品開発における有用性と限界を解明していく。限られた細胞数で培地添加物の探索を効率的に進めるために、96穴のトランスウエルでの培養条件を探索する。同様に、小腸吸収上皮細胞についても、半気相培養時と通常培養時、さらには、FGF等のペプチドの添加、旋回培養等を組み合わせて細胞を培養し、遺伝子発現プロファイルを取得し、トランスポーター機能・代謝機能を定量的に評価することで、in vivo小腸機能を反映したモデルの構築を進める。オーファントランスポーターの機能解析として、SLC35F1について、同定した基質の類似体を中心として基質の拡張や阻害試験を行い、基質選択性に関する情報を取得することで、薬物輸送における重要性を解明するとともに、他のSLC35Fファミリーに属するトランスポーターの機能解析を進める。SLC35G1についてもHEK293細胞を宿主とする強制発現系を用いて、基質の探索を進め、小腸吸収上皮細胞における役割を解明する。
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