| Project/Area Number |
23K27348
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| Project/Area Number (Other) |
23H02657 (2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 48010:Anatomy-related
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
寺田 純雄 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (00262022)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川岸 将彦 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60323606)
齊藤 健太 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 講師 (60374659)
佐藤 啓介 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60644044)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥19,370,000 (Direct Cost: ¥14,900,000、Indirect Cost: ¥4,470,000)
Fiscal Year 2025: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000)
Fiscal Year 2024: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000)
Fiscal Year 2023: ¥13,130,000 (Direct Cost: ¥10,100,000、Indirect Cost: ¥3,030,000)
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| Keywords | 蛍光偏光 / ライブイメージング / 細胞骨格 |
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| Outline of Research at the Start |
従来の蛍光顕微鏡技術では利用されてこなかった蛍光偏光を活用する蛍光偏光プローブ技術-POLArIS法-を発展させ、細胞内広域分子配向イメージングを行い、電子顕微鏡によらなければ不可能であった生体分子の細胞内高次構造動態解析を実時間下に実現する。プローブと蛍光偏光顕微鏡の両者について改良を行い、細胞表層での観察に留まっていた分子配向イメージングを細胞内のより広い領域に拡大する。様々な観察対象から基礎学術的意義の高い知見を獲得することにより、蛍光偏光を利用した三次元的な分子配向イメージングの汎用化を達成する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内の広い領域における分子配向イメージングのための基盤技術開発として、特に新規に設計したタグシステムを利用した汎用プローブ作成の試みに成功した。POLArISプローブ作成の際の律速段階の一つが組換えバインダのスクリーニングであったが、原理的にこのスクリーニングをスキップして任意の標的分子を蛍光偏光標識する手法を確立した。
プローブの強度増強については試行実験を続行している。
また細胞内の広い領域における分子配向イメージングの試みとして、F-actinに結合するPOLArISプローブを薬剤誘導性に発現するトランスジェニックマウスのを利用したアクチン動態観察の準備を進めると共に、比較対象となるヒトデ卵母細胞を利用した検証実験を進めた。トランスジェニックマウスについてはドライバーマウスに予期せぬ問題点があることが判明し、そのトラブルシューティングに腐心したが、これを解決した。
並行して構造生物学的な解析・検討により、当初作成したプローブPOLArISactよりも性状が改善したプローブ作成に成功したので、このプローブを使用してヒトデ卵母細胞の発生過程におけるアクチン動態につき、高感度化した共焦点蛍光偏光顕微鏡を利用して観察した。細胞内におけるアクチン配向イメージングにおける像質が大幅に改善しており、従来知られていなかった細胞内構造変化が観測されつつあり、成果の発表を準備中である。
またこの他、蛍光偏光ライトシート顕微鏡の性能検証も進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
計画の基盤となるプローブの強度増強の試行錯誤で予想外に時間がかかっていること、顕微鏡の像質改善のために背面照射型CMOSカメラの導入を優先し購入を進めたが、海外為替レートの高騰からSLMの導入は厳しい状況にある。他方で新規に設計したタグシステムを利用した汎用プローブ作成の試みに成功したことから、標的分子認識バインダの探索の必要性が解消したので、この項目の遂行はスキップすることとした。ゲノム標識はプローブの強度増強が前提となるため、遂行が遅れている。他方で、改良したプローブ等により、予想外の知見が得られつつあり、こちらについては別途発表を準備している。
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| Strategy for Future Research Activity |
プローブの強度増強が懸案であり、当初予定していた方法とは別のコンセプトでも試行を開始し、状況打開に注力する予定である。POLArISactの改良に成功したのでこのプローブを利用した実験を継続し、成果発表を目指す。また新規に設計したタグシステムを利用した汎用プローブを利用する等により、これまで観察の中心としてきたアクチン分子の他のターゲットについて、分子配向イメージングを実施する。高感度カメラを装着した共焦点レーザー走査型顕微鏡、ライトシート顕微鏡等を使用し、まずアンサンブルの分子動態を観察する予定である。
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