| Project/Area Number |
23K27387
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| Project/Area Number (Other) |
23H02696 (2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 49020:Human pathology-related
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| Research Institution | Sapporo Medical University |
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Principal Investigator |
廣橋 良彦 札幌医科大学, 医学部, 准教授 (30516901)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥18,720,000 (Direct Cost: ¥14,400,000、Indirect Cost: ¥4,320,000)
Fiscal Year 2025: ¥5,850,000 (Direct Cost: ¥4,500,000、Indirect Cost: ¥1,350,000)
Fiscal Year 2024: ¥5,850,000 (Direct Cost: ¥4,500,000、Indirect Cost: ¥1,350,000)
Fiscal Year 2023: ¥7,020,000 (Direct Cost: ¥5,400,000、Indirect Cost: ¥1,620,000)
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| Keywords | 腫瘍浸潤リンパ球 / 腫瘍抗原 / 1細胞遺伝子発現解析 / T細胞受容体 / 腫瘍微小環境 / 空間遺伝子発現解析 / 1細胞解析 |
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| Outline of Research at the Start |
腫瘍微小環境解析は、がん免疫療法、irAEなどの病態を解明する上で重要な解析である。腫瘍微小環境解析において、組織学的解析、分子生物学的解析、免疫学的解析などがあるが、いずれの解析においても得られる情報に偏りがある。しかしながら、複数の解析結果を統合することは困難である。我々はT細胞受容体(TCR)遺伝子配列に着目し、TCR配列は特異な配列を示す事から、TCR配列をアンカーに複数の解析結果の統合を試みる。
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| Outline of Annual Research Achievements |
免疫チェックポイント阻害剤(ICI)を使ったがん免疫療法は、おおむね10%-40%程度の奏効率を示す。細胞傷害性T細胞(CTL)浸潤が多い症例ではICIの有効性が高いとされている。しながら、腫瘍に浸潤するCTL (TIL) の抗原特異性と、抗原特異性による病態形成の概要は未だに不明である。一方では、single cell RNA解析 (scRNA解析）などの技術進歩により、TILの遺伝子発現情報に関して、情報が蓄積されつつある。本研究において、TILの遺伝子発現情報に、抗原特異性情報を合わせて病態解明を目的とする。
本研究では、TILおよび、irAE症例における病的リンパ球が認識する抗原の同定を試みる。具体的に、TILまたは、病的リンパ球のsingle cell TCR(scTCR)解析を行う。また、scRNA解析を行う。scRNA解析結果を統計解析し、疲弊T細胞分画を同定する。抗原特異的T細胞は疲弊T細胞形質を有するからである。疲弊T細胞分画に集積するTCR配列から、TCR遺伝子を合成する。TCR遺伝子を用い、TCR遺伝子改変T細胞(TCR-T細胞)を作製する。TCR-T細胞を用い、抗原スクリーニングを行う。抗原スクリーニング法として、T-Scan法を用いる。また、スクリーニングに用いるcDNAライブラリは、標的となる悪性黒色腫あるいは、肝芽腫細胞を用いる。抗原を同定後、組織内における抗原発現解析を行う。TCR遺伝子情報から、in situ hybridization プローブをデザインし、in situ hybridization によるTCR検出を試みる。抗原発現部位と、抗原特異的T細胞の位置情報を統合的に解析する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究において、CTLが病態に関わると考えられる症例の解析を行っている。具体的に、ICI治療悪性黒色腫症例およびirAE肝炎症例である。ICI治療悪性黒色腫症例では、ICI奏功例および不応例のTILをsingle cell TCR解析(scTCR解析)を行うと同時にsingle cell RNA-seq解析(scRNA解析）を行った。その結果、ICI奏功例および不応例いずれにおいても、scRNA解析からは、疲弊T細胞が存在する事が明らかとなった。この結果は、ICI奏功例、不応例いずれにおいてもTILは腫瘍特異的である可能性が示唆される。また、scTCR解析から得られたTCR配列をもとに、疲弊T細胞由来TCRを導入したTCR-T細胞を作製した。合計20種類のTCR-T細胞を作製した。悪性黒色腫症例の全エキソン配列 (WES) 解析を行った。遺伝子変異情報から、遺伝子変異にコードされるネオアンチゲン候補に対する反応性をスクリーニングした。その結果、当該症例において、ネオアンチゲン特異的TCRは存在しなかった。さらに、悪性黒色腫細胞からcDNAライブラリを作製し、TCR-T細胞でスクリーニングした結果、TCR-T細胞が認識する抗原の一つは、過剰発現型共通抗原であった。
irAE肝炎症例の病的リンパ球scTCR解析から得られたTCR配列をもとに、TCR-T細胞を作製した。このTCR-T細胞が認識する抗原を同定するために、患者HLA遺伝子を過剰発現させた肝芽腫細胞株に対する反応性を検討した。その結果、当該TCR-T細胞はHLA-A24拘束性に反応性を示す事が判明した。現在、当該抗原遺伝子を解析中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
上記、悪性黒色腫症例において、腫瘍特異的反応を示したT細胞および、irAE肝炎症例において、肝芽腫特異的反応を示したT細胞が認識する抗原は、おのおのの病態を理解する上で重要な情報となる。今年度において、引き続き、これらのTCR-T細胞が認識する抗原のスクリーニングを行う。具体的には、悪性黒色腫症例では、悪性黒色腫細胞からcDNAライブラリを作製する。また、irAE肝炎症例では肝芽腫細胞株HepG2からcDNAライブラリを作製する。これら作製したcDNAライブラリを用いて、TCR-T細胞が認識する抗原スクリーニングを行う。また、TCR配列をもとに、in situ hybridizationプローブを作製し、アッセイを行う。TCRの抗原特異性情報、TCRを有する細胞のT細胞フェノタイプ、TCRの組織上での配置の3情報を統合する。組織上において、T細胞機能を解釈する。
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