| Project/Area Number |
23K27420
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| Project/Area Number (Other) |
23H02729 (2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 49060:Virology-related
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| Research Institution | Wakayama Medical University |
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Principal Investigator |
佐藤 慎太郎 和歌山県立医科大学, 薬学部, 教授 (80447333)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
左近 直美 地方独立行政法人 大阪健康安全基盤研究所, 微生物部, 主幹研究員 (50291216)
澤田 晋一 千葉大学, 未来粘膜ワクチン研究開発シナジー拠点, 特任准教授 (50444104)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥18,590,000 (Direct Cost: ¥14,300,000、Indirect Cost: ¥4,290,000)
Fiscal Year 2025: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2024: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2023: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
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| Keywords | ヒトノロウイルス / 腸管上皮細胞 / ワクチン開発 / 細胞外小胞 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究計画では、ヒトノロウイルス（HuNoV）ワクチン開発を念頭に置き、HuNoVのin vitroにおける継代、持続感染の成立を目指した革新的なウイルス増殖法の確立を試みる。実験には申請者らが樹立したヒトiPS細胞株由来の腸管上皮細胞と、この細胞で一度増殖したProgeny HuNoV、およびそのもととなる感染患者由来の糞便懸濁液を用いる。HuNoVはなぜ、in vitroでの増殖効率が悪いのかという学術的問いを掲げ、それらを解明して克服していくことを通して、停滞しているHuNoVのウイルス学的解析を進めていく。
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度までの検討から、糞便懸濁液中のHuNoV粒子は、100℃の加熱によってもその効果が失われない何らかの因子によって「活性化」されている状態であることが予想された。今年度はこの因子の同定をさらに進めた。
HuNoVは口から感染し、胃を通過した後に小腸上皮細胞に感染して爆発的に増殖することが知られており、実際に酸に対して強い耐性を有している。そこで、低pH下に置くことでウイルスの構造タンパク質が変化し、再感染できる様になるのではないかと考え、Progeny HuNoVをクエン酸溶液（pH2.0）と1:9の容量比で混合し、室温で5分インキュベートした。その後、HEPESを含む基礎培地で20倍希釈してpHを中性域（pH6.4）に戻し、腸管上皮細胞に添加した。陰性対照としたPBSとの混合では、Progeny HuNoVのin vitroにおける複製はこれまで通り認められなかったが、クエン酸溶液と混合したものでは、HuNoVを含まない糞便懸濁液と混合し、37℃でインキュベーションした場合に匹敵するほどの複製が認められた。以上の結果は、低pH条件下に置くことにより、不可逆的にProgeny HuNoVの構造が変化し、腸管上皮細胞に再感染できるようになることを強く示唆するものである。
一方で、cCHPナノゲルを用いたウイルス粒子のクラスター化に関しては、糞便懸濁液をウイルス液として用いて実験を行ってみたが、ウイルス粒子以外の不純物（核酸などのマイナスにチャージされた物質や脂質など）がcCHPの凝集を引き起こしてしまい、糞便懸濁液をそのまま使用することが出来ないことが判明した。限外濾過膜を用いたバッファー置換を試みたが、100 kDa以上の不純物が多いためか、ほとんど置換できなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Progeny HuNoVを低pH環境下に数分おくことで、腸管上皮細胞に再感染しさらに複製が進むことを示唆する結果を得ることができたため。一方で、cCHPナノゲルを用いたウイルス粒子のクラスター化に関しては、依然として十分なウイルス量を確保できておらず、次年度に持ち越すこととなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
糞便懸濁液中のProgeny HuNoVを活性化させうる因子の同定をさらに進めるとともに、pHの最適化を行い、一回の感染で複製されたProgeny HuNoVが同一ディッシュ内で再感染能を獲得し、指数関数的に複製が進む条件を確立していきたいと考えている。また、cCHPナノゲルを用いたウイルス粒子のクラスター化に関しては、超遠心を用いたウイルス粒子の精製を研究分担者の左近先生に行って頂き、再度検討する予定である。また、近年報告されているゼブラフィッシュ胚を用いたHuNoV複製系を検討し、上記の実験に用いることが出来るウイルス粒子の確保も試みる。
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