| Project/Area Number |
23K27440
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| Project/Area Number (Other) |
23H02749 (2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 50010:Tumor biology-related
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
仲 一仁 広島大学, 原爆放射線医科学研究所, 准教授 (70372688)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥18,720,000 (Direct Cost: ¥14,400,000、Indirect Cost: ¥4,320,000)
Fiscal Year 2025: ¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2024: ¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2023: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000)
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| Keywords | V-ATPase / リソソーム / 酸性度調節 / プロトンポンプ / CML幹細胞 / 酸 / CMLマウスモデル |
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| Outline of Research at the Start |
がん幹細胞は，抗がん剤治療後のがんの再発原因となるが，生体内でのがん幹細胞の生存維持における“酸”の役割は明らかでない．本研究では，慢性骨髄性白血病 (CML)のマウスモデルを用いて，リソソームでの酸性度調節を担うV-ATPaseの制御メカニズムを解明し，CML幹細胞の自己複製能の維持，及び抗がん剤抵抗性おける酸性度制御の意義を明らかにする．このV-ATPaseの制御メカニズムを解明することで，正常細胞に対する副作用の少ない，がん幹細胞に特異的な酸の制御機構をターゲットとするがんの再発治療法を開発するための科学基盤の確立を目指す．
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，慢性骨髄性白血病(CML)のマウスモデルを用いてリソソームのプロトン輸送をコントロールするV-ATPaseの機能を解析し，CML幹細胞の抗がん剤抵抗性や未分化性の維持における酸性度制御の意義を解明することを目的とした研究を実施している．2023年度，正常造血幹細胞とCML幹細胞との間での遺伝子発現解析を行ない，CML幹細胞はリソソームの酸性度調節に関わるV-ATPaseのAtp6v0e2サブユニットを高発現していることを見出した．次いで，野生型マウス由来の造血幹細胞にAtp6v0e2遺伝子，並びに対照としてGFP遺伝子を導入して，Atp6v0e2・GFP発現造血幹細胞を得た．これらのAtp6v0e2・GFP発現造血幹細胞に対して，ヒトCMLの原因遺伝子であるBCR-ABL1を導入後，マウスに骨髄移植を行なって，CML幹細胞のマウスモデルを構築した．これらのCML発症マウスの生存期間を解析し，CML幹細胞の白血病発症能や未分化性の維持能力におけるAtp6v0e2の役割を解析した．その結果，Atp6v0e2を導入したCML幹細胞を移植したマウスは，GFPを導入したCML幹細胞を移植したマウスと比較して，生存期間が延長して，白血病発症能が低下していることが明らかとなった．さらに，マウス脾臓でのCML幹細胞の細胞数を解析した結果，Atp6v0e2遺伝子を導入したCML幹細胞は，GFPを導入したCML幹細胞と比較して，細胞数が減少していることが判明した．このような結果から，Atp6v0e2はCML幹細胞の増殖・分化を亢進して，未分化性維持能力，並びに白血病発症能を低下させることが明らかとなった.
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
がん幹細胞は，正常幹細胞と類似の未分化性を有する細胞であり，大量のがん細胞を生み出す能力と抗がん剤治療に対する抵抗性を併せ持つことで再発や転移を引き起こす原因になると考えられている．一般に，がん細胞は抗がん剤治療などの栄養飢餓状態でも，オートファジーなどの細胞内での分解機構によって栄養素を再利用して生存・増殖を可能としている．この分解機構にはリソソームの酸が利用されることから，リソソームの酸性度調節はがんの治療標的に位置付けられている．一方で，がん幹細胞は増殖活性を低く抑えた特殊な低代謝状態を獲得することで未分化性を維持している．しかし，これまで，がん幹細胞における“酸”の役割は明らかではない．そこで，本研究では， CMLのマウスモデルを用いて，リソソームの酸性度調節を担うV-ATPaseの制御メカニズムを解明し，CML幹細胞の自己複製能の維持，及び抗がん剤抵抗性における酸性度制御の意義を明らかにすることを目的とした研究を実施している．
リソソームの酸は，ATPのエネルギーを使ってプロトン (酸) の能動輸送を行うV-ATPaseによって制御されている．V-ATPaseは14種類のサブユニットからなる910kDaの巨大な複合体であり, ATPの加水分解を行うV1ユニットやプロトン輸送を行うV0ユニットが知られている．そこで，2023年度，正常造血幹細胞とCML幹細胞との間での遺伝子発現解析を行ない，CML幹細胞はリソソームの酸性度調節に関わるV-ATPaseのAtp6v0e2サブユニットを高発現していることを見出した．さらに，Atp6v0e2を導入したCML幹細胞は増殖・分化が亢進して白血病発症能が低下することから，Atp6v0e2はCML幹細胞の未分化性の維持に重要な役割を担うことを解明した.
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| Strategy for Future Research Activity |
Atp6v0e2導入CML幹細胞，並びに対照としてGFP導入CML幹細胞を用いて，リソソーム活性，及びミトコンドリア選択的オートファジー (マイトファジー) の解析を行い，CML幹細胞のV-ATPの酸性度調節，リソソーム活性，ミトコンドリア制御におけるAtp6v0e2の役割を明らかにする計画である．
【Atp6v0e2 導入CML幹細胞におけるリソソームの酸性度の解析】
GFP・Atp6v0e2 導入CML幹細胞を用いて，LysoTracker (酸性物質の検出)と抗Lamp1抗体 (リソソームマーカー) を用いた蛍光染色を行う．次いで，超高解像度共焦点レーザー顕微鏡 (Stellaris 5, Leica社) による解析を行なって，リソソームの酸性度調節におけるAtp6v0e2の役割を解明する．同様に，リソソームpHセンサー分子を導入して，リソソームでの酸性度調節におけるAtp6v0e2の役割を明らかにする．
【ミトコンドリア選択的オートファジーの解析】
GFP・Atp6v0e2 導入CML幹細胞において，抗LC3抗体 (オートファジーマーカー) ・抗Tom20抗体 (ミトコンドリアマーカー)，抗Pink1抗体, 抗Parkin抗体 を用いた蛍光免疫染色による解析を行い，マイトファジーの解析を行う．また，透過型電子顕微鏡 (JEM-1400, 日本電子社) によりミトコンドリア構造，及びマイトファゴソームに取り囲まれたミトコンドリアの解析を行い，リソソームの酸性度調節によるミトコンドリア制御機構を明らかにする．
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