| Project/Area Number |
23K27518
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| Project/Area Number (Other) |
23H02827 (2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 52020:Neurology-related
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
丸山 博文 広島大学, 医系科学研究科(医), 教授 (90304443)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
森野 豊之 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 教授 (10397953)
倉重 毅志 独立行政法人国立病院機構(呉医療センター臨床研究部), その他部局等, 医師 (20710627)
中森 正博 広島大学, 医系科学研究科(医), 助教 (30881297)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2028-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥18,980,000 (Direct Cost: ¥14,600,000、Indirect Cost: ¥4,380,000)
Fiscal Year 2027: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2026: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2025: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
Fiscal Year 2024: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000)
Fiscal Year 2023: ¥9,620,000 (Direct Cost: ¥7,400,000、Indirect Cost: ¥2,220,000)
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| Keywords | Necroptosis / 軸索 / iPS細胞 / 筋萎縮性側索硬化症 / necroptosis / 逆行性進展 / OPTN / TMEM106B / ALS |
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| Outline of Research at the Start |
初代培養細胞や患者由来iPS細胞を用いてnecroptosis関連タンパク質の解析を行う。特に細胞体と軸索を分離し局所による相違を検討する。
脳内細胞の種類による差を明確にするため、single cell RNA-seqによる解析を行い、炎症・necroptosis・軸索再生に関わる分子を解析する。
並行して患者検体を用いて病理学的検討を行う。
その後モデル細胞を用いた薬剤スクリーニングを行い、有効なものをモデル動物において検討する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は筋萎縮性側索硬化症（ALS）におけるnecroptosisの逆行性進展機序とその阻害による軸索再生の可能性を明らかにすることを目的としている。2023年度には、細胞モデルの樹立、評価法の確立、およびリソソーム膜タンパク質TMEM106Bに対する抗体作製を行った。ヒトALS患者の脊髄・筋内神経束（神経終末）において、RIPK3に加えてnecrosome複合体を構成するRIPK1、MLKLの発現を確認した。
2024年度はOPTN欠損マウス（Optn-KO）とhuman TDP43を異常発現する（ヘテロ接合性）トランスジェニックマウス（Tg）を交配させ、複合変異マウス（TgKO）を作製・解析した。TgおよびTgKO群では、対照群（WT、Optn-KO）と比較して体重変化は少ないものの、運動機能の低下と早期死亡を認めた。神経細胞数はTgおよびTgKO群で有意に減少し、脊髄TDP-43タンパク質量はTgおよびTgKOで上昇していたが、高齢個体（18ヶ月齢）ではTgKO群でTg群よりも低下していた。さらに、TgKO群ではLC3-IIやp62の発現上昇がみられ、高齢期におけるオートファジー制御異常が示唆された。一方、オートファジー経路上流のTBK1タンパク質量には有意差はなかったが、リン酸化TBK1はOptn-KO群で有意に低下し、TBK1-OPTNオートファジー経路の障害が示唆された。また運動神経におけるTDP-43細胞質凝集体はOptn欠損により増加し、OPTNが凝集形成の抑制に関与する可能性が示唆された。ミクログリオーシスはTg群で認められたが、TgKOおよびOptn-KO群では抑制されており、Optn欠損が炎症応答に影響を与えることも示唆された。
今後は、神経細胞に加えグリア細胞での病態解明を目的として、conditional knockoutマウスの作製も検討している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究では運動神経に分化させた患者由来iPS細胞を用いるが、備品、設備、環境のセットアップおよび諸手続きに時間を要した。倫理審査の承認、また、iPS細胞を運動神経に分化させるベクターの供与におけるMTA締結に時間を要したが、それぞれ完了した。iPS細胞を運動神経に分化させるプロトコールの改良も行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、Optn遺伝子改変モデルマウス由来の初代培養神経細胞や、患者由来iPS細胞から運動神経へと分化誘導した細胞を用い、軸索伸長を中心とした形態変化の継時的変化をtime-lapseイメージングにより観察する。加えて、necroptosis関連タンパク質（RIPK1、RIPK3、MLKL、Caspase-8）や、OPTN関連分子（TBK1、NEK1）、軸索輸送関連分子（TDP-43、TMEM106B、myosin VI、Huntingtin）の発現を免疫染色および生化学的解析により定量評価する。細胞体・軸索間の違いに加え、軸索の近位部と遠位部の空間的局在にも着目し、時間的・空間的にnecroptosisの進展過程を可視化する。
さらに、single cell RNA-seqによりニューロン、ミクログリア、アストロサイトの各細胞種ごとの遺伝子発現プロファイルを取得し、炎症・necroptosis・軸索再生に関与する分子群の同定を行う。これにより、病態進展に関与する細胞種とその分子的背景を明確にする。
並行して、保有するALS患者由来検体（死後脳・脊髄組織、生検筋組織）において、necrosome構成分子の蓄積や細胞内分布を免疫染色で評価し、凍結組織を用いたWestern blotおよびRT-qPCRにより発現量を検証する。
これらの知見を基に、モデル細胞系でnecroptosis阻害薬（necrostatin-1、GSK872）やNF-κB阻害薬（Withaferin A）によるスクリーニングを行い、細胞障害の抑制および軸索再生の促進を検証する。効果が確認された候補薬についてはモデル動物を用いたin vivo解析を進め、創薬への応用を目指す。
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