| Project/Area Number |
23K27520
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| Project/Area Number (Other) |
23H02829 (2023)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2024)
Single-year Grants (2023) |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 52020:Neurology-related
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
宮武 聡子 横浜市立大学, 附属病院, 准教授 (50637890)
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| Project Period (FY) |
2024-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥18,850,000 (Direct Cost: ¥14,500,000、Indirect Cost: ¥4,350,000)
Fiscal Year 2025: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2024: ¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000)
Fiscal Year 2023: ¥8,060,000 (Direct Cost: ¥6,200,000、Indirect Cost: ¥1,860,000)
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| Keywords | ロングリードシーケンサー / 神経筋疾患 / 脊髄小脳変性症 / リピート伸長病 / CANVAS / SCA27B / ナノポアシーケンス / ターゲットロングリードシーケンス法 / ロングリードシーケンサ / 筋萎縮性側索硬化症 |
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| Outline of Research at the Start |
近年、ショートリード型次世代シーケンサを用いた全エクソーム解析（WES）のヒト疾患ゲノム研究への応用により原因遺伝子の同定が飛躍的に進んだが、最近では、本解析法による原因同定率は概ね40%前後で頭打ちとなっており、WESでは特定できないゲノム異常の解明が急務となっている。本研究ではWESを行っても原因が特定できていない神経筋疾患症例を対象に、ショートリード型次世代シーケンサの弱点を補完するロングリード型次世代シーケンサによる統合ゲノム解析を行って新規遺伝学的要因を同定し、それを起点に分子病態を明らかにして、治療への道筋をつけることを目指すものである。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本課題は全エクソーム解析を行っても原因が特定できていない神経筋疾患症例を対象に、ショートリード型次世代シーケンサの弱点を補完するロングリード型次世代シーケンサによる統合ゲノム解析を行って遺伝学的要因を同定し、それを起点に分子病態を明らかにして、治療への道筋をつけることを目指すものである。
これまでに、ナノポアシーケンサーを用いた全ゲノム解析を行い、遺伝学的原因未同定の筋萎縮性側索硬化症337例、脊髄小脳変性症96例、眼咽頭遠位型ミオパチー11例のデータを集積した。また、今年度PacBio社の新型シーケンサーであるRevioを用いた全ゲノムシーケンスを開始した。シーケンス条件検討ののち、これまでに脊髄小脳変性症67例、ニューロパチー20例、筋萎縮性側索硬化症4例のシーケンスを行った。
これらのデータを統合させて、リピート伸長、構造異常、難読領域の塩基置換バリアント、メチル化の異常等の観点から新規遺伝要因の探索を行っている。現在までに筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、それぞれについて、複数の症例で統計学的に有意なリピート伸長が見られるローカスを新規疾患責任候補領域として抽出しており新規疾患確立に向け解析を進めている。
2024年度には、最近同定された新たな脊髄小脳失調症であるSCA27B(FGF14-ataxia)について日本人におけるSCA27Bの遺伝学的特徴を明らかにし、Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry誌に発表した（Miyatake S, et al.,2024 JNNP）。その他、本研究課題に関して、他施設と共同で、これまで13本の論文報告を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2024年度は、ONT社のPromethIONシーケンサーを用いて筋萎縮性側索硬化症28例、PacBio社のRevioシーケンサーを用いて脊髄小脳変性症67例、ニューロパチー20例、筋萎縮性側索硬化症4例、眼咽頭遠位型ミオパチー10例の全ゲノム解析を行った。11例で原因同定に至った。
Revioによってリピート伸長病が新たに同定できた9例について、ナノポアターゲットロングリードシーケンスを追加施行し両者のシーケンスデータを比較検討した。リピート伸長解析として、当教室で開発したtandem-genotypes とPacBio社がリリースしたTRGTを用いた。同一検体について、ナノポアシーケンサーとRevioで算出されたリピートモチーフカウント、もしくはリピート長について相関関係を確認した。その結果、短いリピート伸長ほど一致率は高くリピート<100bp未満の場合は両者一致、100-200bpの場合で最大2リピートのずれであった。大きなリピート伸長では、ずれが大きくなる傾向があるもののR2 0.97-0.98と良好な相関関係が得られた。
また本年度、最近同定された新たな脊髄小脳失調症であるSCA27B(FGF14-ataxia)についてナノポアロングリードシーケンスによるリピート配列の完全解読を行い、日本人におけるSCA27Bの遺伝学的特徴について論文発表した（Miyatake S, et al., 2024 JNNP）その他、本研究課題に関して6本の論文報告を行った（Koshimizu et al.,2024 JHG; Matsushima et al., 2024 J Neurol; Ohori et al., 2024 Genomics; Watanabe et al., 2024 J Neurol;Mori et al., 2024 Neurology and Clinical Neuroscience; Mizuguchi et al., 2025 Clin Epigenetics）
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| Strategy for Future Research Activity |
2025年度は、Revioシーケンサーも利用可能なため、疾患特性を考慮してシーケンサーを選択しつつ全ゲノム解析を行っていく。また、両者のデータを相関解析の結果をもとにマージさせて統合解析に進める。
現在までに筋萎縮性側索硬化症2例、眼咽頭遠位型ミオパチー1例で別疾患と関連があるリピート領域の伸長が検出され、未知の表現型―遺伝型連関である可能性があり症例集積中である。
また、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、それぞれについて、複数の症例で統計学的に有意なリピート伸長が見られるローカスを新規疾患責任候補領域として抽出している。各々、候補変異をPCRベースの手法を用いて確認、スクリーニングする手法を確立したので、これまでに集積している同疾患の検体について変異スクリーニングを行い、同じローカスの変異を持つ症例を検索している。候補変異のうち、常染色体劣性遺伝性脊髄小脳変性症と臨床診断されている症例にみられる新規リピートモチーフの伸長変異については、希少疾患と思われるため、他施設と共同で同じ遺伝子変異をもつ症例の検索、集積を進めているところである。必要に応じてGeneMatcher (https://genematcher.org/) 等を適宜利用し同じ所見もつ類似症例の検索を国外に広げる。
複数症例を集積できたら、どのような臨床像を持つ疾患であるかの表現型解析、リピート伸長が発現に与える影響について探索するエピゲノム解析やトランスクリプトーム解析、in vitro, やin vivo の系を用いた変異の病原性検証と病態再現によって新規疾患確立を目指す。
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