| Project/Area Number |
23KF0005
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 外国 |
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| Review Section |
Basic Section 47020:Pharmaceutical analytical chemistry and physicochemistry-related
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
水上 進 東北大学, 多元物質科学研究所, 教授 (30420433)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
LIU MENG-XIAN 東北大学, 多元物質科学研究所, 外国人特別研究員
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| Project Period (FY) |
2023-04-25 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
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| Keywords | 炭素ドット / 脂肪滴 / オルガネラ |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、異なる蛍光色の炭素ドット（CD）を用いて細胞内脂肪滴と標的オルガネラ（ミトコンドリア・小胞体）を同時に可視化する。CD作製技術とオルガネラ・タンパク質標識技術を組み合わせ、標的化可能なCDを作製し、生細胞蛍光イメージングで脂肪滴の分布とオルガネラとの相互作用を調べる。令和5年度には、オルガネラ標的化多色CDを調製し、令和6年度にはタグリガンド修飾CDを合成し、多色CDの標的化特性を評価する。これらの技術を用いて、脂肪滴サブグループの生理機能を解明し、治療法開発に繋げることを目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、様々な種類の細胞内脂肪滴が細胞内のどのようなオルガネラと相互作用するかを調べることを目的とする。その為に、各オルガネラやタグ蛋白質に標的化可能な機能性炭素ドット（Carbon Dot: CD）を開発すえる。これらの機能化CDを長時間の生細胞蛍光イメージングに適用し、異なるクラスの脂肪滴が細胞内でどのように分布し、オルガネラとどのように相互作用するかを調べる。この可視化技術をもとに、脂肪滴サブグループの各々の生理機能を解明し、脂肪滴関連疾患の治療法開発に道筋を拓くことを長期的な目標にする。
まず、オルガネラ標的化多色CDの作製を行った。CDは炭素源から官能基を受け継ぐことができるため、アミノ基やカルボキシ基を有する化学試薬を炭素源として選択し、これらの基を有するCDを合成した。実際に適切な試薬を選択することによって、様々な蛍光色を持つCDを自在に合成できることを確認した。標的オルガネラの一つであるミトコンドリアは負の膜電位を有し、脂質膜でおおわれていることから、疎水性かつカチオン性となるような性質を持つCDを合成することで、ミトコンドリアに局在する赤色蛍光CDの合成に成功した。
また、様々な標的蛋白質を修飾するために、タグ蛋白質としてHaloTagを選択する。令和5年度はCDの表面に修飾するためのアミノ基を有するHaloTagリガンドの合成を完了した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和5年度は、様々な蛍光色および局在性を示すCDの合成法の確立、およびCD表面への官能基修飾に取り組んだ。まず、ミトコンドリアに標的化可能な赤色蛍光を示すCD（R-CD)をクエン酸、L-メチオニン、2,7-ジヒドロキシナフタレンによる高温高圧反応により合成した。この炭素ドットは最大蛍光波長590 nmの赤色蛍光を示し、細胞膜透過性を有していた。MitoTrackerとの共染色によりR-CDがミトコンドリアに局在することを確認した。さらに、475nmに極大蛍光波長を示す青色蛍光CD（B-CD)を合成した。B-CDは、表面にHaloTagリガンドを修飾する予定だが、令和5年度においてアミノ基を有するHaloTagリガンドの合成まで完了した。また、CDのサイズはDLSおよびTEMにより確認した。一方、研究遂行に伴い、新たな課題も見つかった。CDはサイズに依存して蛍光波長がシフトする性質があることから、精密な解析を行う為には、より均一なサイズのCDを合成する必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和６年度は、以下の順に研究を進める。（１）B-CD表面へのHaloTagリガンドの修飾、ならびに細胞内局所に発現させたHaloTagに対して高いS/N比でのラベル化能を有するかについての検討を行う。（２）ERを標的とするCDの開発：長鎖アルキル基を含有する色素を炭素源として選択し、疎水性が高いCDを合成し、ERへの局在化能を検討する。
（３）単一サイズを有するCDの開発：上記と並行して、単分散ポリマーを原料とするCDを開発し、その物性および細胞内局在に関する検討を行う。（４）細胞内脂肪滴関連蛋白質のCDによる蛍光修飾。脂肪滴表面への局在が知られている各蛋白質にHaloTagを融合させ、合成したCDでラベルし、ミトコンドリアおよびERとの局在
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